Higher order chromatin structure presents a barrier to the recognition and repair of DNA damage. Double-strand breaks (DSBs) induce histone H2AX phosphorylation, which is associated with the recruitment of repair factors to damaged DNA. To help clarify the physiological role of H2AX, we targeted H2AX in mice. Although H2AX is not essential for irradiation-induced cell-cycle checkpoints, H2AX-/- mice were radiation sensitive, growth retarded, and immune deficient, and mutant males were infertile. These pleiotropic phenotypes were associated with chromosomal instability, repair defects, and impaired recruitment of Nbs1, 53bp1, and Brca1, but not Rad51, to irradiation-induced foci. Thus, H2AX is critical for facilitating the assembly of specific DNA-repair complexes on damaged DNA.

In a mouse model of colorectal cancer, barrier deterioration results in adenoma invasion by microbial products that trigger tumour-elicited inflammation, which in turn drives IL-23-dependent tumour growth. Approximately 2% of colorectal cancer is linked to pre-existing inflammation known as colitis-associated cancer, but most develops in patients without underlying inflammatory bowel disease. Colorectal cancer often follows a genetic pathway whereby loss of the adenomatous polyposis coli (APC) tumour suppressor and activation of β-catenin are followed by mutations in K-Ras, PIK3CA and TP53, as the tumour emerges and progresses1,2. Curiously, however, ‘inflammatory signature’ genes characteristic of colitis-associated cancer are also upregulated in colorectal cancer3,4. Further, like most solid tumours, colorectal cancer exhibits immune/inflammatory infiltrates5, referred to as ‘tumour-elicited inflammation’6. Although infiltrating CD4+ TH1 cells and CD8+ cytotoxic T cells constitute a positive prognostic sign in colorectal cancer7,8, myeloid cells and T-helper interleukin (IL)-17-producing (TH17) cells promote tumorigenesis5,6, and a ‘TH17 expression signature’ in stage I/II colorectal cancer is associated with a drastic decrease in disease-free survival9. Despite its pathogenic importance, the mechanisms responsible for the appearance of tumour-elicited inflammation are poorly understood. Many epithelial cancers develop proximally to microbial communities, which are physically separated from immune cells by an epithelial barrier10. We investigated mechanisms responsible for tumour-elicited inflammation in a mouse model of colorectal tumorigenesis, which, like human colorectal cancer, exhibits upregulation of IL-23 and IL-17. Here we show that IL-23 signalling promotes tumour growth and progression, and development of a tumoural IL-17 response. IL-23 is mainly produced by tumour-associated myeloid cells that are likely to be activated by microbial products, which penetrate the tumours but not adjacent tissue. Both early and late colorectal neoplasms exhibit defective expression of several barrier proteins. We propose that barrier deterioration induced by colorectal-cancer-initiating genetic lesions results in adenoma invasion by microbial products that trigger tumour-elicited inflammation, which in turn drives tumour growth.

Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) has trophic effects on serotonergic (5-HT) neurons in the central nervous system. However, the role of endogenous BDNF in the development and function of these neurons has not been established in vivo because of the early postnatal lethality of BDNF null mice. In the present study, we use heterozygous BDNF +/− mice that have a normal life span and show that these animals develop enhanced intermale aggressiveness and hyperphagia accompanied by significant weight gain in early adulthood; these behavioral abnormalities are known to correlate with 5-HT dysfunction. Forebrain 5-HT levels and fiber density in BDNF +/− mice are normal at an early age but undergo premature age-associated decrements. However, young adult BDNF +/− mice show a blunted c-fos induction by the specific serotonin releaser-uptake inhibitor dexfenfluramine and alterations in the expression of several 5-HT receptors in the cortex, hippocampus, and hypothalamus. The heightened aggressiveness can be ameliorated by the selective serotonin reuptake inhibitor fluoxetine. Our results indicate that endogenous BDNF is critical for the normal development and function of central 5-HT neurons and for the elaboration of behaviors that depend on these nerve cells. Therefore, BDNF +/− mice may provide a useful model to study human psychiatric disorders attributed to dysfunction of serotonergic neurons.

Abstract

 Background: Cyclin-dependent kinases (Cdks) and their cyclin regulatory subunits control cell growth and division. Cdk2/cyclin E complexes are thought to be required because they phosphorylate the retinoblastoma protein and drive cells through the G1/S transition into the S phase of the cell cycle. In addition, Cdk2 associates with cyclin A, which itself is essential for cell proliferation during early embryonic development. Results: In order to study the functions of Cdk2 in vivo, we generated Cdk2 knockout mice. Surprisingly, these mice are viable, and therefore Cdk2 is not an essential gene in the mouse. However, Cdk2 is required for germ cell development; both male and female Cdk2^−/− mice are sterile. Immunoprecipitates of cyclin E1 complexes from Cdk2^−/− spleen extracts displayed no activity toward histone H1. Cyclin A2 complexes were active in primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs), embryo extracts and in spleen extracts from young animals. In contrast, there was little cyclin A2 kinase activity in immortalized MEFs and spleen extracts from adult animals. Cdk2^−/− MEFs proliferate but enter delayed into S phase. Ectopic expression of Cdk2 in Cdk2^−/− MEFs rescued the delayed entry into S phase. Conclusions: Although Cdk2 is not an essential gene in the mouse, it is required for germ cell development and meiosis. Loss of Cdk2 affects the timing of S phase, suggesting that Cdk2 is involved in regulating progression through the mitotic cell cycle.

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is an archetypical kinase and a central regulator that drives cells through G2 phase and mitosis. Knockouts of Cdk2, Cdk3, Cdk4, or Cdk6 have resulted in viable mice, but the in vivo functions of Cdk1 have not been fully explored in mammals. Here we have generated a conditional-knockout mouse model to study the functions of Cdk1 in vivo. Ablation of Cdk1 leads to arrest of embryonic development around the blastocyst stage. Interestingly, liver-specific deletion of Cdk1 is well tolerated, and liver regeneration after partial hepatectomy is not impaired, indicating that regeneration can be driven by cell growth without cell division. The loss of Cdk1 does not affect S phase progression but results in DNA re-replication because of an increase in Cdk2/cyclin A2 activity. Unlike other Cdks, loss of Cdk1 in the liver confers complete resistance against tumorigenesis induced by activated Ras and silencing of p53.

Abstract Richter’s Transformation (RT) is a poorly understood and fatal progression of chronic lymphocytic leukemia (CLL) manifesting histologically as diffuse large B-cell lymphoma. Protein arginine methyltransferase 5 (PRMT5) is implicated in lymphomagenesis, but its role in CLL or RT progression is unknown. We demonstrate herein that tumors uniformly overexpress PRMT5 in patients with progression to RT. Furthermore, mice with B-specific overexpression of hPRMT5 develop a B-lymphoid expansion with increased risk of death, and Eµ-PRMT5/TCL1 double transgenic mice develop a highly aggressive disease with transformation that histologically resembles RT; where large-scale transcriptional profiling identifies oncogenic pathways mediating PRMT5-driven disease progression. Lastly, we report the development of a SAM-competitive PRMT5 inhibitor, PRT382, with exclusive selectivity and optimal in vitro and in vivo activity compared to available PRMT5 inhibitors. Taken together, the discovery that PRMT5 drives oncogenic pathways promoting RT provides a compelling rationale for clinical investigation of PRMT5 inhibitors such as PRT382 in aggressive CLL/RT cases.

The authors have withdrawn their manuscript. While attempting to reproduce the data on the alternative splicing of exon 2 of U2AF2, they observed that the proposed splicing mechanism could not give rise to a functional U2AF2 protein. In addition, they observed evidence of manipulation in the electropherogram of the splicing junction between exons 1 and 3 and in the primary data on which this electropherogram was based, which were deposited in Mendeley by the first author. These observations raise questions on the integrity of the reported results. In light of this information, the authors have no confidence in the key findings of the paper, and therefore, do not wish it to be cited. If you have any questions, please contact the corresponding author.

Abstract The OsTIR1/auxin-inducible degron (AID) system allows “on demand” selective and reversible protein degradation upon exposure to the phytohormone auxin. In the current format, this technology does not allow to study the effect of acute protein depletion selectively in one phase of the cell cycle, as auxin similarly affects all the treated cells irrespectively of their proliferation status. Therefore, the AID system requires coupling with cell synchronization techniques, which can alter the basal biological status of the studied cell population. Here, we introduce a new AID system to Regulate OsTIR1 Levels based on the Cell Cycle Status (ROLECCS system), which induces proteolysis of both exogenously transfected and endogenous gene-edited targets in specific phases of the cell cycle. This new tool paves the way to studying the differential roles that target proteins may have in specific phases of the cell cycle.

Type I IFNs orchestrate the antiviral response. Interestingly, IFNA1 and IFNB1 genes are naturally intronless. Based on previous work, the splicing factor U2 Associated Factor 65 (U2AF65), encoded by U2AF2, and pre-mRNA Processing factor 19 (Prp19) function on the Cytoplasmic Accumulation Region Elements (CAR-E), affecting the nuclear export of intronless genes. We have previously shown that the loss of IWS1 phosphorylation by AKT3, promotes the alternative RNA splicing of U2AF2, resulting in novel transcripts lacking exon 2. This exon encodes part of the Serine-Rich (RS) domain of U2AF65, which is responsible for its binding with Prp19. Here, we show that IWS1 phosphorylation and the U2AF2 RNA splicing pattern affect the nuclear export of introless mRNAs. We also demonstrate that the same axis is required for the proper function of the CAR-Es. Mechanistically, whereas both U2AF65 isoforms bind CAR-E, the recruitment of Prp19 occurs only in cells expressing phosphorylated IWS1, promoting intronless genes export. Moreover, analysis of Lung adenocarcinoma patients showed that high p-IWS1 activity correlates with the assembly of the U2AF65/Prp19 complex and export of intronless genes, in vivo. Accordingly, the expression of type I IFNs was decreased in cells deficient in IWS1 phosphorylation and the viral infection was increased. Furthermore, following infection with oncolytic virus, we observed reduced activation of p-STAT1 and expression of Interferon Stimulated Genes (ISG), in cells stimulated by shIWS1-derived supernatant, or cells treated with the pan-AKT inhibitor, MK2206. Consistently, killing curves and apoptosis assays after infection with oncolytic viruses, revealed increased susceptibility upon the loss of IWS1, with subsequent activation of Caspase-mediated death. The treatment of the lung adenocarcinoma cells with MK2206, phenocopied the loss of IWS1 phosphorylation. These data identify a novel mechanism by which the AKT/p-IWS1 axis, by hijacking the epigenetic regulation of RNA splicing and processing, contributes to the resistance to oncolytic viral infection, suggesting that combined inhibition of the splicing machinery and AKT/p-IWS1 signals would sensitize tumors to oncolytic viral treatment.

Our previous studies have shown that IWS1 (Interacts with Spt6) is a phosphorylation target of AKT and regulates the alternative RNA splicing of FGFR2, linking IWS1 with human Non-Small Cell Lung Cancer. To further address the role of IWS1 in alternative RNA splicing in lung cancer, we performed an RNA-seq study using lung adenocarcinoma cells in which IWS1 was knocked down or replaced by its phosphorylation site mutant. The results identified a novel, exon 2 deficient splice variant of the splicing factor U2 Associated-Factor 2 (U2AF2), whose abundance increases, upon the loss of phosphorylated IWS1. This exon encodes part of the U2AF65 Serine-Rich (SR) Domain, which is required for its binding with pre-mRNA Processing factor 19 (Prp19). Here, we show that U2AF2 exon 2 inclusion depends on phosphorylated IWS1, by promoting histone H3K36 trimethylation and the assembly of LEDGF/SRSF1 splicing complexes, in a cell-cycle specific manner. Inhibition of the pathway results in the downregulation of cell cycle division associated 5 (CDCA5), a phosphorylation target and regulator of ERK, leading to G2/M phase arrest, impaired cell proliferation and tumor growth in mouse xenografts models, an effect more pronounced in EGFR mutant cells. Analysis of lung adenocarcinoma samples revealed strong correlations between IWS1 phosphorylation, U2AF2 RNA splicing, and Sororin/p-ERK levels, especially in EGFR, as opposed to K-RAS mutant patients. More importantly, IWS1 phosphorylation and U2AF2 RNA splicing pattern are positively correlated with tumor stage, grade and metastasis, and associated with poor survival in the same patients. This work highlights the instrumental role of the AKT/p-IWS1 axis to alternative RNA splicing in governing cell cycle progression and tumorigenesis and proposes this axis as a novel drug target in EGFR mutant lung adenocarcinoma, by concomitantly affecting the epigenetic regulation of RNA processing and oncogenic signals.