Abstract Reconstructing the history of somatic DNA alterations can help understand the evolution of a tumor and predict its resistance to treatment. Single-cell DNA sequencing (scDNAseq) can be used to investigate clonal heterogeneity and to inform phylogeny reconstruction. However, most existing phylogenetic methods for scDNAseq data are designed either for single nucleotide variants (SNVs) or for large copy number alterations (CNAs), or are not applicable to targeted sequencing. Here, we develop COMPASS, a computational method for inferring the joint phylogeny of SNVs and CNAs from targeted scDNAseq data. We evaluate COMPASS on simulated data and apply it to several datasets including a cohort of 123 patients with acute myeloid leukemia. COMPASS detected clonal CNAs that could be orthogonally validated with bulk data, in addition to subclonal ones that require single-cell resolution, some of which point toward convergent evolution.

Abstract Acute myeloid leukemia (AML) and effector cells of immune checkpoint blockade (ICB) therapy co-reside in a complex bone marrow (BM) milieu. The interplay of tumor intrinsic and microenvironment (TME) mechanisms that influences the response to ICB-based therapies in AML have not been elucidated. Here we report our analyses of single cell RNA profiling of more than 127,000 BM cells from healthy donors and relapsed/refractory (R/R) AML patients at pre/post treatment with azacitidine/nivolumab, paired with single cell T cell receptor (TCR) repertoire profiles, to uncover factors impacting response and resistance. Loss of chromosome 7/7q conferred an immunosuppressive TME and was associated with resistance to ICB-based therapy in R/R AML. Our trajectory analysis revealed a continuum of CD8+ T cell phenotypes, characterized by differential expression of granzyme B (GZMB) and GZMK. GZMK expression defined a BM residing memory CD8+ T cell subset with stem-like properties likely an intermediary between naïve and cytotoxic lymphocytes. Responses to ICB-based therapy were primarily driven by novel and expanded T cell clonotypes. Our findings support an adaptable T cell plasticity in response to PD-1 blockade in AML. Disentangling AML cells from their complex, immune-rich microenvironment revealed characteristics that shaped resistance to ICB-based therapy and could inform strategies to target AML vulnerabilities. Significance Determining the cellular and molecular underpinnings of response and resistance to PD-1 blockade based therapy in AML can guide immune-based therapeutic strategies. Our results reveal AML intrinsic characteristics (chromosome 7/7q status and oxidative stressors) and tumor microenvironment to modulate responses to checkpoint blockers. CD8 cells exist in the bone marrow in a continuum with GZMK expression defining a memory, stem-like T cell population that could play a role in response to therapy.

Abstract Allosteric inhibitors of mutant IDH1 or IDH2 induce terminal differentiation of the mutant leukemic blasts and provide durable clinical responses in approximately 40% of acute myeloid leukemia (AML) patients with the mutations. However, primary resistance and acquired resistance to the drugs are major clinical issues. To understand the molecular underpinnings of clinical resistance to IDH inhibitors (IDHi), we performed multipronged genomic analyses (DNA sequencing, RNA sequencing and cytosine methylation profiling) in longitudinally collected specimens from 68 IDH1- or IDH2-mutant AML patients treated with the inhibitors. The analysis revealed that leukemia stemness is a major driver of primary resistance to IDHi, whereas selection of mutations in RUNX1/CEBPA or RAS-RTK pathway genes was the main driver of acquired resistance to IDHi, along with BCOR , homologous IDH gene, and TET2 . These data suggest that targeting stemness and certain high-risk co-occurring mutations may overcome resistance to IDHi in AML.

6519 Background: We report the outcomes of a phase 2 study of FLAG-IDA+VEN in AML. Methods: Pts ≥18 with ND or RR AML / MDS-EB2 fit for intensive chemotherapy were eligible. Induction comprised fludarabine 30mg/m 2 D2–6, cytarabine 1.5g/m 2 D2–6, idarubicin 8 (6 if RR) mg/m 2 D4–6 & filgrastim 5mcg/kg D1–7. VEN 400mg was administered D1–14 with CYP3A inhibitor dose adjustment until Jul 2023; following a protocol modification, VEN is now administered D1–7. The primary outcome was ORR (CR + CRh + CRi + MLFS + PR). Secondary outcomes were CRc (CR + CRh + CRi), overall survival (OS), event-free survival (EFS) & duration of response (DOR). Measurable residual disease (MRD) was assessed by flow cytometry. Results: As of Jan 2024, 134 pts have enrolled, 127 (68 ND & 59 RR) evaluable at data cut. Median age was 45 (18 – 73); 19 (15%) age ≥60. 13 (19%), 22 (32%) & 33 (49%) ND pts were ELN22 favorable, intermediate & adverse respectively. There were 7 (10%) secondary (s), including 4 hypomethylating agent failure, & 7 (10%) therapy-related (t) AML. In RR pts, 40 (68%) were in salvage 1 (S1), of whom 32 (54%) were TP53 WT . 20 (34%) had prior stem cell transplant (SCT). Median of 2 cycles were given. In ND pts, ORR was 99%, (96% CRc, of whom 89% MRD negative [Table]). Similar responses were seen across ELN groups & s/tAML. At median follow-up (mFU) of 30 months (mo), the mOS, mEFS & mDOR were not reached. The 2yr OS, EFS & DOR were 75% (64 – 88), 68% (56 – 81) & 71% (59 – 85) respectively, with no differences among ELN groups. 57% went to SCT in CR1. 4/4 pts with TP53 mut became CRc MRD–, but mDOR was only 8.2 mo (95% CI, 2.2 – NE), resulting in poor mOS (13.5 mo, 95% CI, 8.6 – NE). In RR pts, ORR was 70% (66% CRc, of whom 79% MRD negative [Table]). At mFU 27 mo, the mOS, mEFS & mDOR were 12 (7 – 33), 7 (4 – 23) & 21 (8 – NE) mo respectively. The 2yr OS, EFS & DOR were 40% (28 – 55), 34% (23 – 49) & 49% (35 – 68) respectively. 58% went to SCT. S1+ TP53 WT pts had mOS of 34 mo (12 – NE), with 72% going to SCT. 30d & 60d mortality were 0% & 3%. Of the 4 deaths within 60d, 1 was sepsis-related in CR in a ND pt while 3 were disease-related in NR RR pts. The most frequent adverse event was infection. Grade ≥3 infections, gastrointestinal toxicities & bleeding occurred in 102 (80%), 20 (16%) & 9 (7%) pts respectively. The median time to neutrophil >1x10 9 /L & platelet >50x10 9 /L were 27d & 28d for C1, 39d & 67d for C2 & 35d & 50d for C3 respectively. Conclusions: FLAG-IDA+VEN results in high MRD negative response rates, leading to impressive survival outcomes across ELN risk groups in ND AML. It is an effective salvage regimen for RR AML, especially for S1+ TP53 WT pts. Clinical trial information: NCT03214562 . [Table: see text]

Normal hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) inherently accumulate somatic mutations and lose clonal diversity with age, processes implicated in the development of myeloid malignancies1. The impact of exogenous stressors, such as cancer chemotherapies, on the genomic integrity and clonal dynamics of normal HSPCs is not well defined. We conducted whole-genome sequencing on 1,032 single-cell-derived HSPC colonies from 10 patients with multiple myeloma (MM), who had undergone various chemotherapy regimens. Our findings reveal that melphalan treatment distinctly increases mutational burden with a unique mutation signature, whereas other MM chemotherapies do not significantly affect the normal mutation rate of HSPCs. Among these therapy-induced mutations were several oncogenic drivers such as TET2 and PPM1D. Phylogenetic analysis showed a clonal architecture in post-treatment HSPCs characterized by extensive convergent evolution of mutations in genes such as TP53 and PPM1D. Consequently, the clonal diversity and structure of post-treatment HSPCs mirror those observed in normal elderly individuals, suggesting an accelerated clonal aging due to chemotherapy. Furthermore, analysis of matched therapy-related myeloid neoplasm (t-MN) samples, which occurred 1-8 years later, enabled us to trace the clonal origin of t-MNs to a single HSPC clone among a group of clones with competing malignant potential, indicating the critical role of secondary mutations in dictating clonal dominance and malignant transformation. Our findings suggest that cancer chemotherapy promotes an oligoclonal architecture with multiple HSPC clones possessing competing leukemic potentials, setting the stage for the selective emergence of a singular clone that evolves into t-MNs after acquiring secondary mutations. These results underscore the importance of further systematic research to elucidate the long-term hematological consequences of cancer chemotherapy.

To enable the characterization of genetic heterogeneity in tumor cell populations, we developed a novel microfluidic approach that barcodes amplified genomic DNA from thousands of individual cancer cells confined to droplets. The barcodes are then used to reassemble the genetic profiles of cells from next generation sequencing data. Using this approach, we sequenced longitudinally collected AML tumor populations from two patients and genotyped up to 62 disease relevant loci across more than 16,000 individual cells. Targeted single-cell sequencing was able to sensitively identify tumor cells during complete remission and uncovered complex clonal evolution within AML tumors that was not observable with bulk sequencing. We anticipate that this approach will make feasible the routine analysis of heterogeneity in AML leading to improved stratification and therapy selection for the disease.

Isocitrate dehydrogenases (IDH) are involved in redox control and central metabolism. Mutations in IDH induce epigenetic and transcriptional reprogramming, differentiation bias, BCL-2 dependence and susceptibility to mitochondrial inhibitors in cancer cells. Here we show that high sensitivity to mitochondrial oxidative phosphorylation (OxPHOS) inhibitors is due to an enhanced mitochondrial oxidative metabolism in cell lines, PDX and patients with acute myeloid leukemia (AML) harboring IDH mutation. Along with an increase in TCA cycle intermediates, this AML-specific metabolic behavior mechanistically occurs through the increase in methylation-driven CEBPα- and CPT1a-induced fatty acid oxidation, electron transport chain complex I activity and mitochondrial respiration in IDH1 mutant AML. Furthermore, an IDH mutant inhibitor that significantly and systematically reduces 2-HG oncometabolite transiently reverses mitochondrial FAO and OxPHOS gene signature and activities in patients who responded to the treatment and achieved the remission. However, at relapse or in patients who did not respond, IDH mutant inhibitor failed to block these mitochondrial properties. Accordingly, OxPHOS inhibitors such as IACS-010759 improve anti-AML efficacy of IDH mutant inhibitors alone and in combination with chemotherapy in vivo. This work provides a scientific rationale for combinatory mitochondrial-targeted therapies to treat IDH mutant-positive AML patients, especially those unresponsive to or relapsing from IDH mutant-specific inhibitors.

ABSTRACT There is limited data on the clonal mechanisms underlying leukemogenesis, prognostic factors, and optimal therapy for atypical chronic myeloid leukemia (aCML). We evaluated the clinicopathological features, outcomes, and responses to therapy of 65 patients with aCML. Median age was 67 years (range 46-89). The most frequently mutated genes included ASXL1 (83%), SRSF2 (68%), and SETBP1 (58%). Mutations in SETBP1, SRSF2, TET2 , and GATA2 tended to appear within dominant clones, with frequent SRSF2 and SETBP1 codominance, while other RAS pathway mutations were more likely to appear as minor clones. Acquisition of new, previously undetectable mutations at transformation was observed in 63% of evaluable patients, the most common involving signaling pathway mutations. Hypomethylating agents were associated with the highest response rates and duration. With a median overall survival of 25 months (95% CI 20-30), intensive chemotherapy was associated with worse OS than other treatment modalities, and allogeneic stem cell transplantation was the only therapy associated with improved outcomes (HR 0.044, 95% CI 0.035-0.593, p=0.007). Age, platelet count, BM blast percentage, and serum LDH levels were independent predictors of survival and were integrated in a multivariable model which allowed to predict 1-year and 3-year survival.

Tumour progression is an evolutionary process in which different clones evolve over time, leading to intra-tumour heterogeneity. Interactions between clones can affect tumour evolution and hence disease progression and treatment outcome. Pairs of mutations that are overrepresented in a clonally exclusive fashion over a cohort of patient samples may be suggestive of a synergistic effect between the different clones carrying these mutations. We therefore developed a novel statistical test, called GeneAccord, to identify such gene pairs that are altered in distinct subclones of the same tumour. We analysed our test for calibration and power. By comparing its performance to baseline methods, we demonstrate that to control type I errors, it is essential to account for the evolutionary dependencies among clones. In applying GeneAccord to the single-cell sequencing of a cohort of 123 acute myeloid leukaemia patients, we find 6 clonally exclusive and 2 clonally co-occurring gene pairs. The clonally exclusive pairs mostly involve genes of the key signalling pathways.