The huge increase in the availability of bacterial genomes led us to a point in which we can investigate and query pan-genomes, for example, the full set of genes of a given bacterial species or clade. Here, we used a data set of 1,311 high-quality genomes from the human pathogen Pseudomonas aeruginosa, 619 of which were newly sequenced, to show that a pan-genomic approach can greatly refine the population structure of bacterial species, provide new insights to define species boundaries, and generate hypotheses on the evolution of pathogenicity. The 665-gene P. aeruginosa core genome presented here, which constitutes only 1% of the entire pan-genome, is the first to be in the same order of magnitude as the minimal bacterial genome and represents a conservative estimate of the actual core genome. Moreover, the phylogeny based on this core genome provides strong evidence for a five-group population structure that includes two previously undescribed groups of isolates. Comparative genomics focusing on antimicrobial resistance and virulence genes showed that variation among isolates was partly linked to this population structure. Finally, we hypothesized that horizontal gene transfer had an important role in this respect, and found a total of 3,010 putative complete and fragmented plasmids, 5% and 12% of which contained resistance or virulence genes, respectively. This work provides data and strategies to study the evolutionary trajectories of resistance and virulence in P. aeruginosa.

Abstract Mycobacterium tuberculosis is a clonal pathogen proposed to have co-evolved with its human host for millennia, yet our understanding of its genomic diversity and biogeography remains incomplete. Here we use a combination of phylogenetics and dimensionality reduction to reevaluate the population structure of M. tuberculosis , providing the first in-depth analysis of the ancient East African Indian Lineage 1 and the modern Central Asian Lineage 3 and expanding our understanding of Lineages 2 and 4. We assess sub-lineages using genomic sequences from 4,939 pan-susceptible strains and find 30 new genetically distinct clades that we validate in a dataset of 4,645 independent isolates. We characterize sub-lineage geographic distributions and demonstrate a consistent geographically restricted and unrestricted pattern for 20 groups, including three groups of Lineage 1. We assess the transmissibility of the four major lineages by examining the distribution of terminal branch lengths across the M. tuberculosis phylogeny and identify evidence supporting higher transmissibility in Lineages 2 and 4 than 3 and 1 on a global scale. We define a robust expanded barcode of 95 single nucleotide substitutions (SNS) that allows for the rapid identification of 69 Mtb sub-lineages and 26 additional internal groups. Our results paint a higher resolution picture of the Mtb phylogeny and biogeography.

ABSTRACT Antibiotic resistance among bacterial pathogens poses a major global health threat. M. tuberculosis complex (MTBC) is estimated to have the highest resistance rates of any pathogen globally. Given the slow growth rate and the need for a biosafety level 3 laboratory, the only realistic avenue to scale up drug-susceptibility testing (DST) for this pathogen is to rely on genotypic techniques. This raises the fundamental question of whether a mutation is a reliable surrogate for phenotypic resistance or whether the presence of a second mutation can completely counteract its effect, resulting in major diagnostic errors (i.e. systematic false resistance results). To date, such epistatic interactions have only been reported for streptomycin that is now rarely used. By analyzing more than 31,000 MTBC genomes, we demonstrated that eis C-14T promoter mutation, which is interrogated by several genotypic DST assays endorsed by the World Health Organization, cannot confer resistance to amikacin and kanamycin if it coincides with loss-of-function (LoF) mutations in the coding region of eis . To our knowledge, this represents the first definitive example of antibiotic reversion in MTBC. Moreover, we raise the possibility that mmpR ( Rv0678 ) mutations are not valid markers of resistance to bedaquiline and clofazimine if these coincide with LoF mutation in the efflux pump encoded by mmpS5 ( Rv0677c ) and mmpL5 ( Rv0676c ).

ABSTRACT Introduction Multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis ( Mtb ) is a significant global public health threat. Genotypic resistance prediction from Mtb DNA sequences offers an alternative to laboratory-based drug-susceptibility testing. User-friendly and accurate resistance prediction tools are needed to enable public health and clinical practitioners to rapidly diagnose resistance and inform treatment regimens. Methods We present Translational Genomics platform for Tuberculosis (GenTB), a web-based application to predict antibiotic resistance from next-generation sequence data. The user can choose between two potential predictors, a Random Forest (RF) classifier and a Wide and Deep Neural Network (WDNN) to predict phenotypic resistance to 13 and 10 anti-tuberculosis drugs, respectively. We benchmark GenTB’s predictive performance along with leading TB resistance prediction tools (Mykrobe and TB-Profiler) using a ground truth dataset of 20,408 isolates with laboratory-based drug susceptibility data. Results All four tools reliably predicted resistance to first-line tuberculosis drugs but had varying performance for second-line drugs. The mean sensitivities for GenTB-RF and GenTB-WDNN across the nine shared drugs was 77.6% (95% CI 76.6 - 78.5%) and 75.4% (95% CI 74.5 - 76.4%) respectively, and marginally higher than the sensitivities of TB-Profiler at 74.4% (95% CI 73.4 - 75.3%) and Mykrobe at 71.9% (95% CI 70.9 - 72.9%). The higher sensitivities were at an expense of ≤1.5% lower specificity: Mykrobe 97.6% (95% CI 97.5 - 97.7%), TB-Profiler 96.9% (95% CI 96.7 to 97.0%), GenTB-WDNN 96.2% (95% CI 96.0 to 96.4%), and GenTB-RF 96.1% (95% CI 96.0 to 96.3%). Genotypic resistance sensitivity was 11% and 9% lower for isoniazid and rifampicin respectively, on isolates sequenced at low depth (<10x across 95% of the genome) emphasizing the need to quality control input sequence data before prediction. We discuss differences between tools in reporting results to the user including variants underlying the resistance calls and any novel or indeterminate variants Conclusion GenTB is an easy-to-use online tool to rapidly and accurately predict resistance to anti-tuberculosis drugs. GenTB can be accessed online at https://gentb.hms.harvard.edu , and the source code is available at https://github.com/farhat-lab/gentb-site .

ABSTRACT Phase variation induced by insertions and deletions (INDELs) in genomic homopolymeric tracts (HT) can silence and regulate genes in pathogenic bacteria but this process is not characterized in MTBC adaptation. We leverage 31,428 diverse clinical isolates to identify genomic regions including phase-variants under positive selection. Of 87,651 INDEL events that emerge repeatedly across the phylogeny, 12.4% are phase-variants within HTs (0.02% of the genome by length). We estimated the in-vitro frameshift rate in a neutral HT at 100x the neutral substitution rate at 1.1 × 10 −5 frameshifts/HT/year. Using neutral evolution simulations, we identified 4,098 substitutions and 45 phase-variants to be putatively adaptive to MTBC (P<0.002). We experimentally confirm that a putatively adaptive phase-variant alters the expression of espA, a critical mediator of ESX-1 dependent virulence. Our evidence supports a new hypothesis that phase variation in the ESX-1 system of MTBC can act as a toggle between antigenicity and survival in the host.

Abstract Background Evolutionary pressures on bacterial pathogens can result in phenotypic change including increased virulence, drug resistance, and transmissibility. Understanding the evolution of these phenotypes in nature and the multiple genetic changes needed has historically been difficult due to sparse and contemporaneous sampling. A complete picture of the evolutionary routes frequently travelled by pathogens would allow us to better understand bacterial biology and potentially forecast pathogen population shifts. Methods In this work, we develop a phylogeny-based method to assess evolutionary dependency between mutations. We apply our method to a dataset of 31,428 Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) genomes, a globally prevalent bacterial pathogen with increasing levels of antibiotic resistance. Results We find evolutionary dependency within simultaneously- and sequentially-acquired variation, and identify that genes with dependent sites are enriched in antibiotic resistance and antigenic function. We discover 20 mutations that potentiate the development of antibiotic resistance and 1,003 dependencies that evolve as a consequence antibiotic resistance. Varying by antibiotic, between 9% and 80% of resistant strains harbor a dependent mutation acquired after a resistance-conferring variant. We demonstrate that mutational dependence can not only improve prediction of phenotype (e.g. antibiotic resistance), but can also detect sequential environmental pressures on the pathogen (e.g. the pressures imposed by sequential antibiotic exposure during the course of standard multi-antibiotic treatment). Taken together, our results demonstrate the feasibility and utility of detecting dependent events in the evolution of natural populations. Data and code available at: https://github.com/farhat-lab/DependentMutations

Background: Whole genome sequencing (WGS) can elucidate Mycobacterium tuberculosis (Mtb) transmission patterns but more data is needed to guide its use in high-burden settings. In a household-based transmissibility study of 4,000 TB patients in Lima, Peru, we identified a large MIRU-VNTR Mtb cluster with a range of resistance phenotypes and studied host and bacterial factors contributing to its spread. Methods: WGS was performed on 61 of 148 isolates in the cluster. We compared transmission link inference using epidemiological or genomic data with and without the inclusion of controversial variants, and estimated the dates of emergence of the cluster and antimicrobial drug resistance acquisition events by generating a time-calibrated phylogeny. We validated our findings in genomic data from an outbreak of 325 TB cases in London. Using a larger set of 12,032 public Mtb genomes, we determined bacterial factors characterizing this cluster and under positive selection in other Mtb lineages. Findings: Four isolates were distantly related and the remaining 57 isolates diverged ca. 1968 (95% HPD: 1945-1985). Isoniazid resistance arose once, whereas rifampicin resistance emerged subsequently at least three times. Amplification of other drug resistance occurred as recently as within the last year of sampling. High quality PE/PPE variants and indels added information for transmission inference. We identified five cluster-defining SNPs, including esxV S23L to be potentially contributing to transmissibility. Interpretation: Clusters defined by MIRU-VNTR typing, could be circulating for decades in a high-burden setting. WGS allows for an improved understanding of transmission, as well as bacterial resistance and fitness factors. Funding: The study was funded by the National Institutes of Health (Peru Epi study U19-AI076217 and K01-ES026835 to MRF). The funding sources had no role in any aspect of the study, manuscript or decision to submit it for publication.

Background : Tuberculosis (TB) is a leading cause of death globally from an infectious agent. Understanding the population dynamics of TBs causative agent Mycobacterium tuberculosis (Mtb) in-host is vital for understanding the efficacy of antibiotic treatment. Here we use longitudinally collected clinical Mtb isolates that underwent Whole-Genome Sequencing (WGS) from the sputa of 307 subjects to investigate Mtb diversity during the course of active TB disease. Methods and findings : We excluded cases suspected of reinfection or contamination to analyze data from 200 subjects, 167 of which met microbiological criteria for delayed culture conversion, treatment failure or relapse. Using technical and biological replicate samples, we defined an allele frequency threshold attributable to in-host evolution. Of the 167 subjects with unsuccessful treatment outcome, 27 (16%) developed new resistance mutations between sampling with 20/27 (74%) occurring in patients with pre-existing antibiotic resistance. Low abundance resistance variants at a purity of ≥ 19% in the first isolate predicts fixation of these variants in the subsequent sample with 27.0% sensitivity and 95.8% specificity. We identify significant in-host variation in seven genes associated with antibiotic resistance and twenty other genes, including metabolic genes and genes known to modulate host innate immunity by interacting with TLR2. We confirm Rv0095c, Rv1944c, PPE18 , PPE54 and PPE60 to be under positive selection by assessing phylogenetic convergence across a global and genetically diverse independent sample of 20,352 isolates. Conclusions : Our large sample provides a comprehensive picture of the mutational dynamics in-host during active TB disease. We demonstrate a framework to study temporal changes in Mtb population diversity using average depth WGS data. We show that minor variants can be used to inform antibiotic treatment regimens in patients with TB. Furthermore, we detect a signature of positive selection in-host, possibly stemming from innate immune pressure and informing our understanding of host-pathogen interactions.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

Drug resistance is threatening attempts at tuberculosis epidemic control. Molecular diagnostics for drug resistance that rely on the detection of resistance-related mutations could expedite patient care and accelerate progress in TB eradication. We performed minimum inhibitory concentration testing for 12 anti-TB drugs together with Illumina whole genome sequencing on 1452 clinical Mycobacterium tuberculosis (MTB) isolates. We then used a linear mixed model to evaluate genome wide associations between mutations in MTB genes or noncoding regions and drug resistance, followed by validation of our findings in an independent dataset of 792 patient isolates. Novel associations at 13 genomic loci were confirmed in the validation set, with 2 involving noncoding regions. We found promoter mutations to have smaller average effects on resistance levels than gene body mutations in genes where both can contribute to resistance. Enabled by a quantitative measure of resistance, we estimated the heritability of the resistance phenotype to 11 anti-TB drugs and identify a lower than expected contribution from known resistance genes. We also report the proportion of variation in resistance levels explained by the novel loci identified here. This study highlights the complexity of the genomic mechanisms associated with the MTB resistance phenotype, including the relatively large number of potentially causative or compensatory loci, and emphasizes the contribution of the noncoding portion of the genome.

Abstract Long diagnostic wait times hinder international efforts to address multi-drug resistance in M. tuberculosis . Pathogen whole genome sequencing, coupled with statistical and machine learning models, offers a promising solution. However, generalizability and clinical adoption have been limited in part by a lack of interpretability and verifiability, especially in deep learning methods. Here, we present a deep convolutional neural network (CNN) that predicts the antibiotic resistance phenotypes of M. tuberculosis isolates. The CNN performs with state-of-the-art levels of predictive accuracy. Evaluation of salient sequence features permits biologically meaningful interpretation and validation of the CNN’s predictions, with promising repercussions for functional variant discovery, clinical applicability, and translation to phenotype prediction in other organisms.