Abstract Purpose: Cancer-associated fibroblasts (CAF) are essential components of the stroma that play a critical role in cancer progression. This study aimed to identify novel CAFs markers that might contribute to the invasion and the prognosis of colorectal cancer. Experimental Design: The azoxymethane/dextran sodium sulfate mouse model of sporadic colon cancer represents an adequate source for the isolation of CAFs and normal fibroblasts. By using the explants technique, we purified CAFs and normal fibroblasts from colon tissues. Whole-cell extracts and supernatants were subjected to in-depth quantitative proteomic analysis by tandem mass spectrometry. Further validations of upregulated proteins in CAFs were carried out by chemokine microarray and immunohistochemical analyses of mouse and human tissues. Results: Using a fold-change of 1.4 or more, we found 132 and 125 differentially expressed proteins in whole-cell extracts and supernatants, respectively. We found CAFs-associated proinflammatory and desmoplastic signatures. The proinflammatory signature was composed of several cytokines. Among them, CCL2 and CCL8 caused an increase in migration and invasion of colorectal cancer KM12 cells. The desmoplastic signature was composed of 30 secreted proteins. In mouse and human samples, expression of LTBP2, CDH11, OLFML3, and, particularly, FSTL1 was significantly increased in the tumoral stroma, without significant expression in the cancer epithelial cells. The combination of CALU and CDH11 stromal expression showed a significant association with disease-free survival and poor prognosis. Conclusion: We have identified LTBP2, CDH11, OLFML3, and FSTL1 as selective biomarkers of cancer stroma, and CALU and CDH11 as candidate stromal biomarkers of prognostic significance in colon cancer. Clin Cancer Res; 19(21); 6006–19. ©2013 AACR.

We present a concise workflow to enhance the mass spectrometric detection of crosslinked peptides by introducing sequential digestion and the crosslink identification software Xi. Sequential digestion enhances peptide detection by selective shortening of long tryptic peptides. We demonstrate our simple 12-fraction protocol for crosslinked multi-protein complexes and cell lysates, quantitative analysis, and high-density crosslinking, without requiring specific crosslinker features. This overall approach reveals dynamic protein-protein interaction sites, which are accessible, have fundamental functional relevance and are therefore ideally suited for the development of small molecule inhibitors.

SUMMARY Mitochondria are increasingly recognized as cellular hubs to orchestrate signaling pathways that regulate metabolism, redox homeostasis, and cell fate decisions. Recent research revealed a role of mitochondria also in innate immune signaling, however, the mechanisms of how mitochondria affect signal transduction are poorly understood. Here we show that the NF-ĸB pathway activated by TNF employs mitochondria as a platform for signal amplification and shuttling of activated NF-ĸB to the nucleus. TNF induces the recruitment of HOIP, the catalytic component of the linear ubiquitin chain assembly complex (LUBAC), and its substrate NEMO to the outer mitochondrial membrane, where M1- and K63-linked ubiquitin chains are generated. NF-ĸB is locally activated and transported to the nucleus by mitochondria, resulting in an increase in mitochondria-nucleus contact sites in a HOIP-dependent manner. Notably, TNF-induced stabilization of the mitochondrial kinase PINK1 contributes to signal amplification by antagonizing the M1-ubiquitin-specific deubiquitinase OTULIN.

Abstract The microtubule network is formed from polymerised Tubulin subunits and associating proteins, which govern microtubule dynamics and a diverse array of functions. To identify novel microtubule binding proteins, we have developed an unbiased biochemical assay, which relies on the selective extraction of cytosolic proteins from cells, whilst leaving behind the microtubule network. Candidate proteins are linked to microtubules by their sensitivities to the depolymerising drug Nocodazole or the microtubule stabilising drug, Taxol, which is quantitated by mass spectrometry. Our approach is benchmarked by co-segregation of Tubulin and previously established microtubule-binding proteins. We then identify several novel candidate microtubule binding proteins, from which we have selected the ubiquitin E3 ligase TRIM3 (Tripartite motif-containing protein 3) for further characterisation. We map TRIM3 microtubule binding to its C-terminal NHL-repeat region. We show that TRIM3 is required for the accumulation of acetylated Tubulin, following treatment with Taxol. Furthermore, loss of TRIM3, partially recapitulates the reduction in Nocodazole-resistant microtubules characteristic of Alpha-Tubulin Acetyltransferase 1 (ATAT1) depletion. These results can be explained by a decrease in ATAT1 following depletion of TRIM3 that is independent of transcription.