Single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) offers new possibilities to address biological and medical questions. However, systematic comparisons of the performance of diverse scRNA-seq protocols are lacking. We generated data from 583 mouse embryonic stem cells to evaluate six prominent scRNA-seq methods: CEL-seq2, Drop-seq, MARS-seq, SCRB-seq, Smart-seq, and Smart-seq2. While Smart-seq2 detected the most genes per cell and across cells, CEL-seq2, Drop-seq, MARS-seq, and SCRB-seq quantified mRNA levels with less amplification noise due to the use of unique molecular identifiers (UMIs). Power simulations at different sequencing depths showed that Drop-seq is more cost-efficient for transcriptome quantification of large numbers of cells, while MARS-seq, SCRB-seq, and Smart-seq2 are more efficient when analyzing fewer cells. Our quantitative comparison offers the basis for an informed choice among six prominent scRNA-seq methods, and it provides a framework for benchmarking further improvements of scRNA-seq protocols.

Abstract Single-cell transcriptomics allows the identification of cellular types, subtypes and states through cell clustering. In this process, similar cells are grouped before determining co-expressed marker genes for phenotype inference. The performance of computational tools is directly associated to their marker identification accuracy, but the lack of an optimal solution challenges a systematic method comparison. Moreover, phenotypes from different studies are challenging to integrate, due to varying resolution, methodology and experimental design. In this work we introduce matchSCore ( https://github.com/elimereu/matchSCore ) , an approach to match cell populations fast across tools, experiments and technologies. We compared 14 computational methods and evaluated their accuracy in clustering and gene marker identification in simulated data sets. We further used matchSCore to project cell type identities across mouse and human cell atlas projects. Despite originating from different technologies, cell populations could be matched across data sets, allowing the assignment of clusters to reference maps and their annotation.

Single-cell genomics is an alluring area that holds the potential to change the way we understand cell populations. Due to the small amount of DNA within a single cell, whole-genome amplification becomes a mandatory step in many single-cell applications. Unfortunately, single-cell whole-genome amplification (scWGA) strategies suffer from several technical biases that complicate the posterior interpretation of the data. Here we compared the performance of six different scWGA methods (GenomiPhi, REPLIg, TruePrime, Ampli1, MALBAC, and PicoPLEX) after amplifying and low-pass sequencing the complete genome of 230 healthy/tumoral human cells. Overall, REPLIg outperformed competing methods regarding DNA yield, amplicon size, amplification breadth, amplification uniformity -being the only method with a random amplification bias-, and false single-nucleotide variant calls. On the other hand, non-MDA methods, and in particular Ampli1, showed less allelic imbalance and ADO, more reliable copy-number profiles and less chimeric amplicons. While no single scWGA method showed optimal performance for every aspect, they clearly have distinct advantages. Our results provide a convenient guide for selecting a scWGA method depending on the question of interest while revealing relevant weaknesses that should be considered during the analysis and interpretation of single-cell sequencing data.

Single-cell RNA sequencing significantly deepened our insights into complex tissues and latest techniques are capable processing ten-thousands of cells simultaneously. Increasing cell numbers, however, generate extremely large datasets, extending processing time and challenging computing resources. Current scRNAseq analysis tools are not designed to analyze datasets larger than thousands of cells and often lack sensitivity to identify marker genes. With bigSCale, we provide an analytical framework being scalable to analyze millions of cells, addressing challenges of future large datasets. To handle the noise and sparsity of scRNAseq data, bigSCale uses large sample sizes to estimate an accurate numerical model of noise. The framework further includes modules for differential expression analysis, cell clustering and marker identification. A directed convolution strategy allows processing of extremely large datasets, while preserving transcript information from individual cells. We evaluated the performance of bigSCale using a biological model of aberrant gene expression in patient derived neuronal progenitor cells and simulated datasets, which underlined its speed and accuracy in differential expression analysis. To test its applicability for large datasets, we applied bigSCale to analyze 1.3 million cells from the mouse developing forebrain. Its directed down-sampling strategy accumulates information from single cells into index cell transcriptomes, thereby defining cellular clusters with improved resolution. Accordingly, index cell clusters identified rare populations, such as Reelin positive Cajal-Retzius neurons, for which we determined a previously not recognized heterogeneity associated to distinct differentiation stages, spatial organization and cellular function. Together, bigSCale presents a perfect solution to address future challenges of large single-cell datasets.

A variety of single cell RNA preparation procedures have been described. So far these protocols require fresh starting material, hindering complex study designs. We describe a sample preservation method that maintains transcripts in viable single cells and so allows to disconnect time and place of sampling from subsequent processing steps. To demonstrate the potential, we sequenced single cell transcriptomes from >1,000 fresh and conserved cells. Our results confirmed that the conservation process did not alter transcriptional profiles. This substantially broadens the scope of applications in single cell transcriptomics and could lead to a paradigm shift in future study designs.

Many somatic cell types are plastic, having the capacity to convert into other specialized cells (transdifferentiation)(1) or into induced pluripotent stem cells (iPSCs, reprogramming)(2) in response to transcription factor over-expression. To explore what makes a cell plastic and whether these different cell conversion processes are coupled, we exposed bone marrow derived pre-B cells to two different transcription factor overexpression protocols that efficiently convert them either into macrophages or iPSCs and monitored the two processes over time using single cell gene expression analysis. We found that even in these highly efficient cell fate conversion systems, cells differ in both their speed and path of transdifferentiation and reprogramming. This heterogeneity originates in two starting pre-B cell subpopulations, large pre-BII and the small pre-BII cells they normally differentiate into. The large cells transdifferentiate slowly but exhibit a high efficiency of iPSC reprogramming. In contrast, the small cells transdifferentiate rapidly but are highly resistant to reprogramming. Moreover, the large B cells induce a stronger transient granulocyte/macrophage progenitor (GMP)-like state, while the small B cells undergo a more direct conversion to the macrophage fate. The large cells are cycling and exhibit high Myc activity whereas the small cells are Myc low and mostly quiescent. The observed heterogeneity of the two cell conversion processes can therefore be traced to two closely related cell types in the starting population that exhibit different types of plasticity. These data show that a somatic cell's propensity for either transdifferentiation and reprogramming can be uncoupled.