The incorporation of histone H3 variants has been implicated in the epigenetic memory of cellular state. Using genome editing with zinc-finger nucleases to tag endogenous H3.3, we report genome-wide profiles of H3 variants in mammalian embryonic stem cells and neuronal precursor cells. Genome-wide patterns of H3.3 are dependent on amino acid sequence and change with cellular differentiation at developmentally regulated loci. The H3.3 chaperone Hira is required for H3.3 enrichment at active and repressed genes. Strikingly, Hira is not essential for localization of H3.3 at telomeres and many transcription factor binding sites. Immunoaffinity purification and mass spectrometry reveal that the proteins Atrx and Daxx associate with H3.3 in a Hira-independent manner. Atrx is required for Hira-independent localization of H3.3 at telomeres and for the repression of telomeric RNA. Our data demonstrate that multiple and distinct factors are responsible for H3.3 localization at specific genomic locations in mammalian cells.

We hypothesized that DNA methylation distributes into specific patterns in cancer cells, which reflect critical biological differences. We therefore examined the methylation profiles of 344 patients with acute myeloid leukemia (AML). Clustering of these patients by methylation data segregated patients into 16 groups. Five of these groups defined new AML subtypes that shared no other known feature. In addition, DNA methylation profiles segregated patients with CEBPA aberrations from other subtypes of leukemia, defined four epigenetically distinct forms of AML with NPM1 mutations, and showed that established AML1-ETO, CBFb-MYH11, and PML-RARA leukemia entities are associated with specific methylation profiles. We report a 15 gene methylation classifier predictive of overall survival in an independent patient cohort (p < 0.001, adjusted for known covariates).

We report a high-quality draft of the genome sequence of the grey, short-tailed opossum (Monodelphis domestica). As the first metatherian ('marsupial') species to be sequenced, the opossum provides a unique perspective on the organization and evolution of mammalian genomes. Distinctive features of the opossum chromosomes provide support for recent theories about genome evolution and function, including a strong influence of biased gene conversion on nucleotide sequence composition, and a relationship between chromosomal characteristics and X chromosome inactivation. Comparison of opossum and eutherian genomes also reveals a sharp difference in evolutionary innovation between protein-coding and non-coding functional elements. True innovation in protein-coding genes seems to be relatively rare, with lineage-specific differences being largely due to diversification and rapid turnover in gene families involved in environmental interactions. In contrast, about 20% of eutherian conserved non-coding elements (CNEs) are recent inventions that postdate the divergence of Eutheria and Metatheria. A substantial proportion of these eutherian-specific CNEs arose from sequence inserted by transposable elements, pointing to transposons as a major creative force in the evolution of mammalian gene regulation.

The distribution of cytosine methylation in 6.2 Mb of the mouse genome was tested using cohybridization of genomic representations from a methylation-sensitive restriction enzyme and its methylation-insensitive isoschizomer. This assay, termed HELP ( H paII tiny fragment E nrichment by L igation-mediated P CR), allows both intragenomic profiling and intergenomic comparisons of cytosine methylation. The intragenomic profile shows most of the genome to be contiguous methylated sequence with occasional clusters of hypomethylated loci, usually but not exclusively at promoters and CpG islands. Intergenomic comparison found marked differences in cytosine methylation between spermatogenic and brain cells, identifying 223 new candidate tissue-specific differentially methylated regions (T-DMRs). Bisulfite pyrosequencing confirmed the four candidates tested to be T-DMRs, while quantitative RT-PCR for two genes with T-DMRs located at their promoters showed the HELP data to be correlated with gene activity at these loci. The HELP assay is robust, quantitative, and accurate and is providing new insights into the distribution and dynamic nature of cytosine methylation in the genome.

Sex differences are found in brain structure and function across species, and across brain disorders in humans 1-3 . The major source of brain sex differences is differential secretion of steroid hormones from the gonads across the lifespan 4 . Specifically, ovarian hormones oestrogens and progesterone are known to dynamically change structure and function of the adult female brain, having a major impact on psychiatric risk 5-7 . However, due to limited molecular studies in female rodents 8 , very little is still known about molecular drivers of female-specific brain and behavioural plasticity. Here we show that overexpressing Egr1, a candidate oestrous cycle-dependent transcription factor 9 , induces sex-specific changes in ventral hippocampal neuronal chromatin, gene expression, and synaptic plasticity, along with hippocampus-dependent behaviours. Importantly, Egr1 overexpression mimics the high-oestrogenic phase of the oestrous cycle, and affects behaviours in ovarian hormone-depleted females but not in males. We demonstrate that Egr1 opens neuronal chromatin directly across the sexes, although with limited genomic overlap. Our study not only reveals the first sex-specific chromatin regulator in the brain, but also provides functional evidence that this sex-specific gene regulation drives neuronal gene expression, synaptic plasticity, and anxiety- and depression-related behaviour. Our study exemplifies an innovative sex-based approach to studying neuronal gene regulation 1 in order to understand sex-specific synaptic and behavioural plasticity and inform novel brain disease treatments.

Abstract Cytosine modifications in DNA such as 5-methylcytosine (5mC) underlie a broad range of developmental processes, maintain cellular lineage specification, and can define or stratify cancer and other diseases. However, the wide variety of approaches available to interrogate these modifications has created a need for harmonized materials, methods, and rigorous benchmarking to improve genome-wide methylome sequencing applications in clinical and basic research. Here, we present a multi-platform assessment and a global resource for epigenetics research from the FDA’s Epigenomics Quality Control (EpiQC) Group. The study design leverages seven human cell lines that are designated as reference materials and publicly available from the National Institute of Standards and Technology (NIST) and Genome in a Bottle (GIAB) consortium. These samples were subject to a variety of genome-wide methylation interrogation approaches across six independent laboratories, with a primary focus was on 5-methylcytosine modifications. Each sample was processed in two or more technical replicates by three whole-genome bisulfite sequencing (WGBS) protocols (TruSeq DNA methylation, Accel-NGS MethylSeq, and SPLAT), oxidative bisulfite sequencing (TrueMethyl), one enzymatic deamination method (EMseq), targeted methylation sequencing (Illumina Methyl Capture EPIC), and single-molecule long-read nanopore sequencing from Oxford Nanopore Technologies. After rigorous quality assessment and comparison to Illumina EPIC methylation microarrays and testing on a range of algorithms (Bismark, BitmapperBS, BWAMeth, and GemBS), we found overall high concordance between assays (R=0.87-R0.93), differences in efficency of read mapping and CpG capture and coverage, and platform performance. The data provided herein can guide continued used of these reference materials in epigenomics assays, as well as provide best practices for epigenomics research and experimental design in future studies.

The mechanism and significance of epigenetic variability in the same cell type between healthy individuals are not clear. Here, we purify human CD34+ hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from different individuals and find that there is increased variability of DNA methylation at loci with properties of promoters and enhancers. The variability is especially enriched at candidate enhancers near genes transitioning between silent and expressed states, and encoding proteins with leukocyte differentiation properties. Our findings of increased variability at loci with intermediate DNA methylation values, at candidate "poised" enhancers, and at genes involved in HSPC lineage commitment suggest that CD34+ cell subtype heterogeneity between individuals is a major mechanism for the variability observed. Epigenomic studies performed on cell populations, even when purified, are testing collections of epigenomes, or meta-epigenomes. Our findings show that meta-epigenomic approaches to data analysis can provide insights into cell subpopulation structure.

ABSTRACT The Assay for Transposase Accessible Chromatin by sequencing (ATAC-seq) is becoming increasingly popular in the neuroscience field where chromatin regulation is thought to be involved in neurodevelopment, activity-dependent gene regulation, hormonal and environmental responses, and the pathophysiology of neuropsychiatric disorders. The advantages of using this assay include a small amount of material needed, relatively simple and fast protocol, and the ability to capture a range of gene regulatory elements with a single assay. However, with increasing interest in chromatin research, it is an imperative to have feasible, reliable assays that are compatible with a range of neuroscience study designs in both animals and humans. Here we tested three different protocols for neuronal chromatin accessibility analysis, including a varying brain tissue freezing method followed by fluorescent-activated nuclei sorting (FANS) and the ATAC-seq analysis. Our study shows that the cryopreservation method impacts the number of open chromatin regions that can be identified from frozen brain tissue using the cell-type specific ATAC-seq assay. However, we show that all three protocols generate consistent and robust data and enable the identification of functional regulatory elements, promoters and enhancers, in neuronal cells. Our study also implies that the broad biological interpretation of chromatin accessibility data is not significantly affected by the freezing condition. In comparison to the mouse brain analysis, we reveal the additional challenges of doing chromatin analysis on post mortem human brain tissue. However, we also show that these studies are revealing important cell type-specific information about gene regulation in the human brain. Overall, the ATAC-seq coupled with FANS is a powerful method to capture cell-type specific chromatin accessibility information in the mouse and human brain. Our study provides alternative brain preservation methods that generate high quality ATAC-seq data while fitting in different study designs, and further encourages the use of this method to uncover the role of epigenetic (dys)regulation in healthy and malfunctioning brain.

Extreme fetal growth is associated with increased susceptibility to a range of adult diseases through an unknown mechanism of cellular memory. We tested whether heritable epigenetic processes in long-lived CD34+ hematopoietic stem/progenitor cells (HSPCs) showed evidence for re-programming associated with the extremes of fetal growth. Here we show that both fetal growth restriction and over-growth are associated with global shifts towards DNA hypermethylation, targeting cis-regulatory elements in proximity to genes involved in glucose homeostasis and stem cell function. A sexually dimorphic response was found, intrauterine growth restriction (IUGR) associated with substantially greater epigenetic dysregulation in males but large for gestational age (LGA) growth affecting females predominantly. The findings are consistent with extreme fetal growth interacting with variable fetal susceptibility to influence cellular aging and metabolic characteristics through epigenetic mechanisms, potentially generating biomarkers that could identify infants at higher risk for chronic disease later in life.

Summary: High-Throughput Sequencing can enhance the analysis of aptamer libraries generated by the Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (HTS-SELEX). Robust analysis of the resulting sequenced rounds is best implemented by determining a ranked consensus of reads following the processing by multiple aptamer detection algorithms. Whilst several such approaches have been developed to this end, their installation and implementation is problematic. We developed AptCompare, a cross-platform program that combines six of the most widely used analytical approaches for the identification of RNA aptamer motifs and uses a simple weighted ranking to order the candidate aptamers, all driven within the same GUI-enabled environment. We demonstrate AptCompare's performance by identifying the top-ranked candidate aptamers from a previously published selection experiment in our laboratory, with follow-up bench assays demonstrating good correspondence between the sequences' rankings and their binding affinities. Availability and Implementation: The source code and pre-built virtual machine images are freely available at https://bitbucket.org/shiehk/aptcompare.