Spatial mapping of proteins in tissues is hindered by limitations in multiplexing, sensitivity and throughput. Here we report immunostaining with signal amplification by exchange reaction (Immuno-SABER), which achieves highly multiplexed signal amplification via DNA-barcoded antibodies and orthogonal DNA concatemers generated by primer exchange reaction (PER). SABER offers independently programmable signal amplification without in situ enzymatic reactions, and intrinsic scalability to rapidly amplify and visualize a large number of targets when combined with fast exchange cycles of fluorescent imager strands. We demonstrate 5- to 180-fold signal amplification in diverse samples (cultured cells, cryosections, formalin-fixed paraffin-embedded sections and whole-mount tissues), as well as simultaneous signal amplification for ten different proteins using standard equipment and workflows. We also combined SABER with expansion microscopy to enable rapid, multiplexed super-resolution tissue imaging. Immuno-SABER presents an effective and accessible platform for multiplexed and amplified imaging of proteins with high sensitivity and throughput. A DNA-based amplification scheme enables highly multiplexed immunofluorescence imaging

Fluorescence in situ hybridization (FISH) reveals the abundance and positioning of nucleic acid sequences in fixed samples. Despite recent advances in multiplexed amplification of FISH signals, it remains challenging to achieve high levels of simultaneous amplification and sequential detection with high sampling efficiency and simple workflows. Here we introduce signal amplification by exchange reaction (SABER), which endows oligonucleotide-based FISH probes with long, single-stranded DNA concatemers that aggregate a multitude of short complementary fluorescent imager strands. We show that SABER amplified RNA and DNA FISH signals (5- to 450-fold) in fixed cells and tissues. We also applied 17 orthogonal amplifiers against chromosomal targets simultaneously and detected mRNAs with high efficiency. We then used 10-plex SABER-FISH to identify in vivo introduced enhancers with cell-type-specific activity in the mouse retina. SABER represents a simple and versatile molecular toolkit for rapid and cost-effective multiplexed imaging of nucleic acid targets.

We present Light-Seq, an approach for multiplexed spatial indexing of intact biological samples using light-directed DNA barcoding in fixed cells and tissues followed by ex situ sequencing. Light-Seq combines spatially targeted, rapid photocrosslinking of DNA barcodes onto complementary DNAs in situ with a one-step DNA stitching reaction to create pooled, spatially indexed sequencing libraries. This light-directed barcoding enables in situ selection of multiple cell populations in intact fixed tissue samples for full-transcriptome sequencing based on location, morphology or protein stains, without cellular dissociation. Applying Light-Seq to mouse retinal sections, we recovered thousands of differentially enriched transcripts from three cellular layers and discovered biomarkers for a very rare neuronal subtype, dopaminergic amacrine cells, from only four to eight individual cells per section. Light-Seq provides an accessible workflow to combine in situ imaging and protein staining with next generation sequencing of the same cells, leaving the sample intact for further analysis post-sequencing.

Abstract Immunofluorescence (IF) imaging using antibodies to visualize specific biomolecules is a widely used technique in both biological and clinical laboratories. Standard IF imaging methods using primary antibodies followed by secondary antibodies have low multiplexing capability due to limited availability of primary antibodies raised in different animal species. Here, we used a DNA-based signal amplification method, Hybridization Chain Reaction (HCR), to replace secondary antibodies to achieve multiplexed imaging using primary antibodies of the same species with superior signal intensity. To enable imaging with DNA-conjugated antibodies, we developed a new antibody staining protocol to minimize nonspecific binding of antibodies caused by conjugated DNA oligonucleotides. We also expanded the HCR hairpin pool from previously published 5 to 13 for highly multiplexed in situ imaging. We finally demonstrated multiplexed in situ protein imaging using the technique in both cultured cells and mouse retina sections.

Spatially resolved omics technologies are transforming our understanding of biological tissues. However, the handling of uni- and multimodal spatial omics datasets remains a challenge owing to large data volumes, heterogeneity of data types and the lack of flexible, spatially aware data structures. Here we introduce SpatialData, a framework that establishes a unified and extensible multiplatform file-format, lazy representation of larger-than-memory data, transformations and alignment to common coordinate systems. SpatialData facilitates spatial annotations and cross-modal aggregation and analysis, the utility of which is illustrated in the context of multiple vignettes, including integrative analysis on a multimodal Xenium and Visium breast cancer study.

Abstract Antibodies have long served as vital tools in biological and clinical laboratories for the specific detection of proteins. Conventional methods employ fluorophore or horseradish peroxidase-conjugated antibodies to detect signals. More recently, DNA-conjugated antibodies have emerged as a promising technology, capitalizing on the programmability and amplification capabilities of DNA to enable highly multiplexed and ultrasensitive protein detection. However, the nonspecific binding of DNA-conjugated antibodies has impeded the widespread adoption of this approach. Here, we present a novel DNA-conjugated antibody staining protocol that addresses these challenges and demonstrates superior performance in suppressing nonspecific signals compared to previously published protocols. We further extend the utility of DNA-conjugated antibodies for signal-amplified in situ protein imaging through the hybridization chain reaction (HCR) and design a novel HCR DNA pair to expand the HCR hairpin pool from the previously published 5 pairs to 13, allowing for flexible hairpin selection and higher multiplexing. Finally, we demonstrate highly multiplexed in situ protein imaging using these techniques in both cultured cells and tissue sections.

Probing the molecular organization of tissues requires in situ analysis by microscopy. However current limitations in multiplexing, sensitivity, and throughput collectively constitute a major barrier for comprehensive single-cell profiling of proteins. Here, we report Immunostaining with Signal Amplification By Exchange Reaction (Immuno-SABER), a rapid, highly multiplexed signal amplification method that simultaneously tackles these key challenges. Immuno-SABER utilizes DNA-barcoded antibodies and provides a method for highly multiplexed signal amplification via modular orthogonal DNA concatemers generated by Primer Exchange Reaction. This approach offers the capability to preprogram and control the amplification level independently for multiple targets without in situ enzymatic reactions, and the intrinsic scalability to rapidly amplify and image a large number of protein targets. We validated our approach in diverse sample types including cultured cells, cryosections, FFPE sections, and whole mount tissues. We demonstrated independently tunable 5-180-fold amplification for multiple targets, covering the full signal range conventionally achieved by secondary antibodies to tyramide signal amplification, as well as simultaneous signal amplification for 10 different proteins using standard equipment and workflow. We further combined Immuno-SABER with Expansion Microscopy to enable rapid and highly multiplexed super-resolution tissue imaging. Overall, Immuno-SABER presents an effective and accessible platform for rapid, multiplexed imaging of proteins across scales with high sensitivity.

Fluorescent in situ hybridization (FISH) reveals the abundance and positioning of nucleic acid sequences in fixed samples and can be combined with cell segmentation to produce a powerful single cell gene expression assay. However, it remains difficult to label more than a few targets and to visualize nucleic acids in environments such as thick tissue samples using conventional FISH technologies. Recently, methods have been developed for multiplexed amplification of FISH signals, yet it remains challenging to achieve high levels of simultaneous multiplexing combined with high sampling efficiency and simple workflows. Here, we introduce signal amplification by exchange reaction (SABER), which endows oligo-based FISH probes with long, single-stranded DNA concatemers that serve as targets for sensitive fluorescent detection. We establish that SABER effectively amplifies the signal of probes targeting nucleic acids in fixed cells and tissues, can be deployed against at least 17 targets simultaneously, and detects mRNAs with high efficiency. As a demonstration of the utility of SABER in assays involving genetic manipulations, we apply multiplexed FISH of reporters and cell type markers to the identification of enhancers with cell type-specific activity in the mouse retina. SABER represents a simple and versatile molecular toolkit to allow rapid and cost effective multiplexed imaging.

Oligonucleotide (oligo)-based fluorescence in situ hybridization (FISH) has emerged as an important tool for the study of chromosome organization and gene expression and has been empowered by the commercial availability of highly complex pools of oligos. However, a dedicated bioinformatic design utility has yet to be created specifically for the purpose of identifying optimal oligo FISH probe sequences on the genome-wide scale. Here, we introduce OligoMiner, a rapid and robust computational pipeline for the genome-scale design of oligo FISH probes that affords the scientist exact control over the parameters of each probe. Our streamlined method uses standard bioinformatic file formats, allowing users to seamlessly integrate existing and new utilities into the pipeline as desired, and introduces a novel method for evaluating the specificity of each probe molecule that connects simulated hybridization energetics to rapidly generated sequence alignments using supervised learning. We demonstrate the scalability of our approach by performing genome-scale probe discovery in numerous model organism genomes and showcase the performance of the resulting probes with both diffraction-limited and single-molecule super-resolution imaging of chromosomal and RNA targets. We anticipate this pipeline will make the FISH probe design process much more accessible and will more broadly facilitate the design of pools of hybridization probes for a variety of applications.