Spatial mapping of proteins in tissues is hindered by limitations in multiplexing, sensitivity and throughput. Here we report immunostaining with signal amplification by exchange reaction (Immuno-SABER), which achieves highly multiplexed signal amplification via DNA-barcoded antibodies and orthogonal DNA concatemers generated by primer exchange reaction (PER). SABER offers independently programmable signal amplification without in situ enzymatic reactions, and intrinsic scalability to rapidly amplify and visualize a large number of targets when combined with fast exchange cycles of fluorescent imager strands. We demonstrate 5- to 180-fold signal amplification in diverse samples (cultured cells, cryosections, formalin-fixed paraffin-embedded sections and whole-mount tissues), as well as simultaneous signal amplification for ten different proteins using standard equipment and workflows. We also combined SABER with expansion microscopy to enable rapid, multiplexed super-resolution tissue imaging. Immuno-SABER presents an effective and accessible platform for multiplexed and amplified imaging of proteins with high sensitivity and throughput. A DNA-based amplification scheme enables highly multiplexed immunofluorescence imaging

Abstract Immunofluorescence (IF) imaging using antibodies to visualize specific biomolecules is a widely used technique in both biological and clinical laboratories. Standard IF imaging methods using primary antibodies followed by secondary antibodies have low multiplexing capability due to limited availability of primary antibodies raised in different animal species. Here, we used a DNA-based signal amplification method, Hybridization Chain Reaction (HCR), to replace secondary antibodies to achieve multiplexed imaging using primary antibodies of the same species with superior signal intensity. To enable imaging with DNA-conjugated antibodies, we developed a new antibody staining protocol to minimize nonspecific binding of antibodies caused by conjugated DNA oligonucleotides. We also expanded the HCR hairpin pool from previously published 5 to 13 for highly multiplexed in situ imaging. We finally demonstrated multiplexed in situ protein imaging using the technique in both cultured cells and mouse retina sections.

Abstract Antibodies have long served as vital tools in biological and clinical laboratories for the specific detection of proteins. Conventional methods employ fluorophore or horseradish peroxidase-conjugated antibodies to detect signals. More recently, DNA-conjugated antibodies have emerged as a promising technology, capitalizing on the programmability and amplification capabilities of DNA to enable highly multiplexed and ultrasensitive protein detection. However, the nonspecific binding of DNA-conjugated antibodies has impeded the widespread adoption of this approach. Here, we present a novel DNA-conjugated antibody staining protocol that addresses these challenges and demonstrates superior performance in suppressing nonspecific signals compared to previously published protocols. We further extend the utility of DNA-conjugated antibodies for signal-amplified in situ protein imaging through the hybridization chain reaction (HCR) and design a novel HCR DNA pair to expand the HCR hairpin pool from the previously published 5 pairs to 13, allowing for flexible hairpin selection and higher multiplexing. Finally, we demonstrate highly multiplexed in situ protein imaging using these techniques in both cultured cells and tissue sections.

Probing the molecular organization of tissues requires in situ analysis by microscopy. However current limitations in multiplexing, sensitivity, and throughput collectively constitute a major barrier for comprehensive single-cell profiling of proteins. Here, we report Immunostaining with Signal Amplification By Exchange Reaction (Immuno-SABER), a rapid, highly multiplexed signal amplification method that simultaneously tackles these key challenges. Immuno-SABER utilizes DNA-barcoded antibodies and provides a method for highly multiplexed signal amplification via modular orthogonal DNA concatemers generated by Primer Exchange Reaction. This approach offers the capability to preprogram and control the amplification level independently for multiple targets without in situ enzymatic reactions, and the intrinsic scalability to rapidly amplify and image a large number of protein targets. We validated our approach in diverse sample types including cultured cells, cryosections, FFPE sections, and whole mount tissues. We demonstrated independently tunable 5-180-fold amplification for multiple targets, covering the full signal range conventionally achieved by secondary antibodies to tyramide signal amplification, as well as simultaneous signal amplification for 10 different proteins using standard equipment and workflow. We further combined Immuno-SABER with Expansion Microscopy to enable rapid and highly multiplexed super-resolution tissue imaging. Overall, Immuno-SABER presents an effective and accessible platform for rapid, multiplexed imaging of proteins across scales with high sensitivity.