Abstract Lowering of prion protein (PrP) expression in the brain is a genetically validated therapeutic hypothesis in prion disease. We recently showed that antisense oligonucleotide (ASO)-mediated PrP suppression extends survival and delays disease onset in intracerebrally prion-infected mice in both prophylactic and delayed dosing paradigms. Here, we examine the efficacy of this therapeutic approach across diverse paradigms, varying the dose and dosing regimen, prion strain, treatment timepoint, and examining symptomatic, survival, and biomarker readouts. We recapitulate our previous findings with additional PrP-targeting ASOs, and demonstrate therapeutic benefit against four additional prion strains. We demonstrate that less than 25% PrP suppression is sufficient to extend survival and delay symptoms in a prophylactic paradigm. Rise in both neuroinflammation and neuronal injury markers can be reversed by a single dose of PrP-lowering ASO administered after the detection of pathological change. Chronic ASO-mediated suppression of PrP beginning at any time up to early signs of neuropathology confers benefit similar to constitutive heterozygous PrP knockout. Remarkably, even after emergence of frank symptoms including weight loss, a single treatment prolongs survival by months in a subset of animals. These results support ASO-mediated PrP lowering, and PrP-lowering therapeutics in general, as a promising path forward against prion disease.

Abstract Upstream open reading frames (uORFs) are important tissue-specific cis -regulators of protein translation. Although isolated case reports have shown that variants that create or disrupt uORFs can cause disease, genetic sequencing approaches typically focus on protein-coding regions and ignore these variants. Here, we describe a systematic genome-wide study of variants that create and disrupt human uORFs, and explore their role in human disease using 15,708 whole genome sequences collected by the Genome Aggregation Database (gnomAD) project. We show that 14,897 variants that create new start codons upstream of the canonical coding sequence (CDS), and 2,406 variants disrupting the stop site of existing uORFs, are under strong negative selection. Furthermore, variants creating uORFs that overlap the CDS show signals of selection equivalent to coding loss-of-function variants, and uORF-perturbing variants are under strong selection when arising upstream of known disease genes and genes intolerant to loss-of-function variants. Finally, we identify specific genes where perturbation of uORFs is likely to represent an important disease mechanism, and report a novel uORF frameshift variant upstream of NF2 in families with neurofibromatosis. Our results highlight uORF-perturbing variants as an important and under-recognised functional class that can contribute to penetrant human disease, and demonstrate the power of large-scale population sequencing data to study the deleteriousness of specific classes of non-coding variants.

Abstract Therapies currently in preclinical development for prion disease seek to lower prion protein (PrP) expression in the brain. Trials of such therapies are likely to rely on quantification of PrP in cerebrospinal fluid (CSF) as a pharmacodynamic biomarker and possibly as a trial endpoint. Studies using PrP ELISA kits have reproducibly shown that CSF PrP is lowered in the symptomatic phase of disease, a potential confounder for reading out the effect of PrP-lowering drugs in symptomatic patients. To date it has been unclear whether the reduced abundance of PrP in CSF results from its incorporation into plaques, retention in intracellular compartments, downregulation as a function of the disease process, or other factors. Because misfolding or proteolytic cleavage could potentially render PrP invisible to ELISA even if its concentration were constant or increasing in disease, we sought to establish an orthogonal method for CSF PrP quantification. We developed a targeted mass spectrometry method based on multiple reaction monitoring (MRM) of nine PrP tryptic peptides quantified relative to known concentrations of isotopically labeled standards. Analytical validation experiments showed process replicate coefficients of variation below 15%, good dilution linearity and recovery, and suitable performance for both CSF and brain homogenate and across humans as well as preclinical species of interest. In N =55 CSF samples from individuals referred to prion surveillance centers with rapidly progressive dementia, all six human PrP peptides, spanning the N- and C-terminal domains of PrP, were uniformly reduced in prion disease cases compared to individuals with non-prion diagnoses. This confirms the findings from ELISA studies, demonstrating that lowered CSF PrP concentration in prion disease is a genuine result of the disease process and not merely an artifact of ELISA-based measurement. We provide a targeted mass spectrometry-based method suitable for preclinical and clinical quantification of CSF PrP as a tool for drug development.

Abstract Phenotypic screening has yielded small molecule inhibitors of prion replication that are effective in vivo against certain prion strains but not others. Here we sought to test the small molecule anle138b in multiple mouse models of prion disease. In mice inoculated with the RML strain of prions, anle138b doubled survival and durably suppressed astrogliosis measured by live animal bioluminescence imaging. In knock-in mouse models of the D178N and E200K mutations that cause genetic prion disease, however, we were unable to identify a clear, quantifiable disease endpoint against which to measure therapeutic efficacy. Among untreated animals, the mutations did not impact overall survival, and bioluminescence remained low out to >20 months of age. Vacuolization and PrP deposition were observed in some brain regions in a subset of mutant animals, but appeared unable to carry the weight of a primary endpoint in a therapeutic study. We conclude that not all animal models of prion disease are suited to well-powered therapeutic efficacy studies, and care should be taken in choosing the models that will support drug development programs.

Regulatory agencies worldwide have adopted programs to facilitate drug development for diseases where the traditional approach of a randomized trial with a clinical endpoint is expected to be prohibitively lengthy or difficult. Here we provide quantitative evidence that this criterion is met for the prevention of genetic prion disease. We assemble age of onset or death data from N=1,094 individuals with high penetrance mutations in the prion protein gene (PRNP), generate survival and hazard curves, and estimate statistical power for clinical trials. We show that, due to dramatic and unexplained variability in age of onset, randomized preventive trials would require hundreds or thousands of at-risk individuals in order to be statistically powered for an endpoint of clinical onset, posing prohibitive cost and delay and likely exceeding the number of individuals available for such trials. Instead, the characterization of biomarkers suitable to serve as surrogate endpoints will be essential for the prevention of genetic prion disease. Biomarker-based trials may require post-marketing studies to confirm clinical benefit. Parameters such as longer trial duration, increased enrollment, and the use of historical controls in a post-marketing study could provide opportunities for subsequent determination of clinical benefit.

Recent work by Shah and colleagues demonstrated that many variants in the ClinVar database are misclassified, and that disease-specific allele frequency (AF) thresholds can identify wrongly classified alleles by flagging variants that are too prevalent in the population to be causative of rare penetrant disease. While we agree with the main conclusions of this work, the authors compare their AF filtering approach to our recently published method, concluding that the method we advanced 'may be prone to removing potentially pathogenic variants'. This is incorrect. Here we demonstrate that our approach is robust, and further illustrate the power of disease-specific AF thresholds for investigating the genetic architecture of disease.

Naturally occurring human genetic variants predicted to cause loss of function of protein-coding genes provide an in vivo model of human gene inactivation that complements cell and model organism knockout studies. Here we investigate the application of human loss-of-function variants to assess genes as candidate drug targets, with three key findings. First, even essential genes, where loss-of-function variants are not tolerated, can be highly successful as targets of inhibitory drugs. Second, in most genes, loss-of-function variants are sufficiently rare that genotype-based ascertainment of homozygous or compound heterozygous “knockout” humans will await sample sizes ~1,000 times those available at present. Third, automated variant annotation and filtering are powerful, but manual curation remains critical for removing artifacts and making biological inferences, and is a prerequisite for recall-by-genotype efforts. Our results provide a roadmap for human “knockout” studies and should guide interpretation of loss-of-function variants in drug development.

ABSTRACT Prion disease is a fatal neurodegenerative disease caused by the conformational corruption of the prion protein (PrP), encoded by the prion protein gene ( PRNP ). While no disease-modifying therapy is currently available, genetic and pharmacological proofs of concept support development of therapies that lower PrP levels in the brain. In light of proposals for clinical testing of such drugs in presymptomatic individuals at risk for genetic prion disease, extensive nonclinical data are likely to be required, with extra attention paid to choice of animal models. Uniquely, the entire prion disease process can be faithfully modeled through transmission of human prions to non-human primates (NHPs), raising the question of whether NHP models should be used to assess therapeutic efficacy. Here we systematically aggregate data from N=527 prion-inoculated animals spanning six decades of research studies. Using this dataset, we assess prion strain, route of administration, endpoint, and passage number to characterize the relationship of tested models to currently prevalent human subtypes of prion disease. We analyze the incubation times observed across diverse models and perform power calculations to assess the practicability of testing prion disease therapeutic efficacy in NHPs. We find that while some models may theoretically be able to support therapeutic efficacy studies, pilot studies would be required to confirm incubation time and attack rate before pivotal studies could be designed, cumulatively requiring several years. The models with the shortest and most tightly distributed incubation times are those with smaller brains and weaker homology to humans. Our findings indicate that it would be challenging to conduct efficacy studies in NHPs in a paradigm that honors the potential advantages of NHPs over other available models, on a timeframe that would not risk unduly delaying patient access to promising drug candidates.

Human genetic variants predicted to cause loss-of-function of protein-coding genes (pLoF variants) provide natural in vivo models of human gene inactivation, and can be valuable indicators of gene function and the potential toxicity of therapeutic inhibitors targeting these genes[1][1],[2][2]. Gain-of-kinase-function variants in LRRK2 are known to significantly increase the risk of Parkinson’s disease[3][3],[4][4], suggesting that inhibition of LRRK2 kinase activity is a promising therapeutic strategy. While preclinical studies in model organisms have raised some on-target toxicity concerns[5][5]–[8][6], the biological consequences of LRRK2 inhibition have not been well-characterized in humans. Here we systematically analyse pLoF variants in LRRK2 observed across 141,456 individuals sequenced in the Genome Aggregation Database (gnomAD)[9][7], 49,960 exome sequenced individuals from the UK Biobank, and over 4 million participants in the 23andMe genotyped dataset. After stringent variant curation, we identify 1,455 individuals with high-confidence pLoF variants in LRRK2 , 82.5% with experimental validation. We show that heterozygous pLoF variants in LRRK2 reduce LRRK2 protein levels but are not strongly associated with reduced life expectancy, or with any specific phenotype or disease state. These data suggest that therapeutics that partially downregulate LRRK2 levels or kinase activity are unlikely to have major on-target safety liabilities. Our results demonstrate the value of large-scale genomic databases and phenotyping of human LoF carriers for target validation in drug discovery. [1]: #ref-1 [2]: #ref-2 [3]: #ref-3 [4]: #ref-4 [5]: #ref-5 [6]: #ref-8 [7]: #ref-9

ABSTRACT Antisense oligonucleotides (ASOs) dosed into cerebrospinal fluid (CSF) distribute broadly throughout the brain and hold the promise of treating myriad brain diseases by modulating RNA. CNS tissue is not routinely biopsied in living individuals, leading to reliance on CSF biomarkers to inform on drug target engagement. Animal models can link CSF biomarkers to brain parenchyma, but our understanding of how individual cells contribute to bulk tissue signal is limited. Here we employed single nucleus transcriptomics on tissue from mice treated with RNase H1 ASOs against Prnp and Malat1 and macaques treated with an ASO against PRNP . Activity was observed in every cell type, though sometimes with substantial differences in magnitude. Single cell RNA count distributions implied target suppression in every single sequenced cell, rather than intense knockdown in only some cells. Duration of action up to 12 weeks post-dose differed across cell types, being shorter in microglia than in neurons. Suppression in neurons was generally similar to, or more robust than, the bulk tissue. In macaques, PrP in CSF was lowered 40% in conjunction with PRNP knockdown across all cell types including neurons, arguing that a CSF biomarker readout is likely to reflect disease-relevant cells in a neuronal disorder.