ABSTRACT Protein translation programs often select the longest open reading frame (ORF) in a transcript leading to numerous inaccurate and mis-annotated ORFs in databases. Unproductive transcript isoforms containing premature termination codons (PTCs) are potential substrates for nonsense-mediated decay (NMD). These transcripts often contain truncated ORFs but are incorrectly annotated due to selection of a long ORF beginning at an AUG downstream of the PTC despite the transcript containing the authentic translation start AUG. In gene expression and alternative splicing analyses, it is important to identify transcript isoforms which code for different protein variants and to distinguish these from potential NMD substrates. Here, we present TranSuite, a pipeline of bioinformatics tools that address these challenges by performing accurate translations, characterizing alternative ORFs and identifying NMD and other features of transcripts in newly assembled and existing transcriptomes. Directly comparing ORFs defined by TranSuite and TransDecoder for the Arabidopsis transcriptome AtRTD2 identified ORF mis-calling in over 16k (27%) of transcripts by TransDecoder.

Many drugs act very rapidly; they can turn on or off their targets within minutes in a whole animal. What are the acute effects of drug treatment and how does an animal respond to these? We developed a simple assay to measure the acute effects of drugs on C. elegans movement and examined the effects of a range of compounds including neuroactive drugs, toxins, environmental stresses and novel compounds on worm movement over a time period of 3 hours. We find that many treatments show complex acute responses, where a phase of rapid paralysis is followed by one or more recovery phases. The recoveries are not the result of some generic stress response but are specific to the drug e.g. recovery from paralysis due to a neuroactive drug requires neurotransmitter pathways whereas recovery from a metabolic inhibitor requires metabolic changes. Finally, we also find that acute responses can vary greatly across development and that there is extensive and complex natural variation in acute responses. In summary, acute responses are sensitive probes of the ability of biological networks to respond to drug treatment and these responses can reveal the action of unexplored pathways.

Parasitic helminths infect over a billion humans. To survive in the low oxygen environment of their hosts, these parasites use unusual anaerobic metabolism. This requires Rhodoquinone (RQ), an electron carrier that is made by very few animal species - crucially it is not present in any parasitic hosts. RQ synthesis is thus an ideal target for anthelmintics but little is known about how RQ is made and no drugs are known to block RQ synthesis. C. elegans makes RQ and can use RQ-dependent metabolic pathways - here, we use C. elegans genetics to identify the pathway for RQ synthesis and show that C. elegans requires RQ for survival in hypoxic conditions. Finally, we establish a robust assay for drugs that block RQ-dependent metabolism. This study identifies for the first time how RQ is made in any animal and establishes a novel assay that can drive the development of a new class of anthelmintic drugs.

Background Alternative splicing is the major post-transcriptional mechanism by which gene expression is regulated and affects a wide range of processes and responses in most eukaryotic organisms. RNA-sequencing (RNA-seq) can generate genome-wide quantification of individual transcript isoforms to identify changes in expression and alternative splicing. RNA-seq is an essential modern tool but its ability to accurately quantify transcript isoforms depends on the diversity, completeness and quality of the transcript information. Results We have developed a new Reference Transcript Dataset for Arabidopsis (AtRTD2) for RNA-seq analysis containing over 82k non-redundant transcripts, whereby 74,194 transcripts originate from 27,667 protein-coding genes. A total of 13,524 protein-coding genes have at least one alternatively spliced transcript in AtRTD2 such that about 60% of the 22,453 protein-coding, intron-containing genes in Arabidopsis undergo alternative splicing. More than 600 putative U12 introns were identified in more than 2,000 transcripts. AtRTD2 was generated from transcript assemblies of ca. 8.5 billion pairs of reads from 285 RNA-seq data sets obtained from 129 RNA-seq libraries and merged along with the previous version, AtRTD, and Araport11 transcript assemblies. AtRTD2 increases the diversity of transcripts and through application of stringent filters represents the most extensive and accurate transcript collection for Arabidopsis to date. We have demonstrated a generally good correlation of alternative splicing ratios from RNA-seq data analysed by Salmon and experimental data from high resolution RT-PCR. However, we have observed inaccurate quantification of transcript isoforms for genes with multiple transcripts which have variation in the lengths of their UTRs. This variation is not effectively corrected in RNA-seq analysis programmes and will therefore impact RNA-seq analyses generally. To address this, we have tested different genome-wide modifications of AtRTD2 to improve transcript quantification and alternative splicing analysis. As a result, we release AtRTD2-QUASI specifically for use in Quantification of Alternatively Spliced Isoforms and demonstrate that it out-performs other available transcriptomes for RNA-seq analysis. Conclusions We have generated a new transcriptome resource for RNA-seq analyses in Arabidopsis (AtRTD2) designed to address quantification of different isoforms and alternative splicing in gene expression studies. Experimental validation of alternative splicing changes identified inaccuracies in transcript quantification due to UTR length variation. To solve this problem, we also release a modified reference transcriptome, AtRTD2-QUASI for quantification of transcript isoforms, which shows high correlation with experimental data.