ABSTRACT Extracellular vesicles (EVs) are small, heterogeneous and difficult to measure. Flow cytometry (FC) is a key technology for the measurement of individual particles, but its application to the analysis of EVs and other submicron particles has presented many challenges and has produced a number of controversial results, in part due to limitations of instrument detection, lack of robust methods and ambiguities in how data should be interpreted. These complications are exacerbated by the field's lack of a robust reporting framework, and many EV‐FC manuscripts include incomplete descriptions of methods and results, contain artefacts stemming from an insufficient instrument sensitivity and inappropriate experimental design and lack appropriate calibration and standardization. To address these issues, a working group (WG) of EV‐FC researchers from ISEV, ISAC and ISTH, worked together as an EV‐FC WG and developed a consensus framework for the minimum information that should be provided regarding EV‐FC. This framework incorporates the existing Minimum Information for Studies of EVs (MISEV) guidelines and Minimum Information about a FC experiment (MIFlowCyt) standard in an EV‐FC‐specific reporting framework (MIFlowCyt‐EV) that supports reporting of critical information related to sample staining, EV detection and measurement and experimental design in manuscripts that report EV‐FC data. MIFlowCyt‐EV provides a structure for sharing EV‐FC results, but it does not prescribe specific protocols, as there will continue to be rapid evolution of instruments and methods for the foreseeable future. MIFlowCyt‐EV accommodates this evolution, while providing information needed to evaluate and compare different approaches. Because MIFlowCyt‐EV will ensure consistency in the manner of reporting of EV‐FC studies, over time we expect that adoption of MIFlowCyt‐EV as a standard for reporting EV‐ FC studies will improve the ability to quantitatively compare results from different laboratories and to support the development of new instruments and assays for improved measurement of EVs.

ABSTRACT Extracellular vesicles (EVs) mediate targeted cellular interactions in normal and pathophysiological conditions and are increasingly recognised as potential biomarkers, therapeutic agents and drug delivery vehicles. Based on their size and biogenesis, EVs are classified as exosomes, microvesicles and apoptotic bodies. Due to overlapping size ranges and the lack of specific markers, these classes cannot yet be distinguished experimentally. Currently, it is a major challenge in the field to define robust and sensitive technological platforms being suitable to resolve EV heterogeneity, especially for small EVs (sEVs) with diameters below 200 nm, i.e. smaller microvesicles and exosomes. Most conventional flow cytometers are not suitable for the detection of particles being smaller than 300 nm, and the poor availability of defined reference materials hampers the validation of sEV analysis protocols. Following initial reports that imaging flow cytometry (IFCM) can be used for the characterisation of larger EVs, we aimed to investigate its usability for the characterisation of sEVs. This study set out to identify optimal sample preparation and instrument settings that would demonstrate the utility of this technology for the detection of single sEVs. By using CD63eGFP‐labelled sEVs as a biological reference material, we were able to define and optimise IFCM acquisition and analysis parameters on an Amnis ImageStreamX MkII instrument for the detection of single sEVs. In addition, using antibody‐labelling approaches, we show that IFCM facilitates robust detection of different EV and sEV subpopulations in isolated EVs, as well as unprocessed EV‐containing samples. Our results indicate that fluorescently labelled sEVs as biological reference material are highly useful for the optimisation of fluorescence‐based methods for sEV analysis. Finally, we propose that IFCM will help to significantly increase our ability to assess EV heterogeneity in a rigorous and reproducible manner, and facilitate the identification of specific subsets of sEVs as useful biomarkers in various diseases.

Flow cytometry (FCM) offers a multiparametric technology capable of characterizing single extracellular vesicles (EVs). However, most flow cytometers are designed to detect cells, which are larger than EVs. Whereas cells exceed the background noise, signals originating from EVs partly overlap with the background noise, thereby making EVs more difficult to detect than cells. This technical mismatch together with complexity of EV-containing fluids causes limitations and challenges with conducting, interpreting and reproducing EV FCM experiments. To address and overcome these challenges, researchers from the International Society for Extracellular Vesicles (ISEV), International Society for Advancement of Cytometry (ISAC), and the International Society on Thrombosis and Haemostasis (ISTH) joined forces and initiated the EV FCM working group. To improve the interpretation, reporting, and reproducibility of future EV FCM data, the EV FCM working group published an ISEV position manuscript outlining a framework of minimum information that should be reported about an FCM experiment on single EVs (MIFlowCyt-EV). However, the framework contains limited background information. Therefore, the goal of this compendium is to provide the background information necessary to design and conduct reproducible EV FCM experiments. This compendium contains background information on EVs, the interaction between light and EVs, FCM hardware, experimental design and preanalytical procedures, sample preparation, assay controls, instrument data acquisition and calibration, EV characterization, and data reporting. Although this compendium focuses on EVs, many concepts and explanations could also be applied to FCM detection of other particles within the EV size range, such as bacteria, lipoprotein particles, milk fat globules, and viruses.

Virtually all cells release extracellular vesicles (EVs) into their environment, such as exosomes and microvesicles. EVs can mediate intercellular communication processes in a targeted manner. Representing their cell of origin, EVs contain cell type specific signatures, qualifying them as a novel class of biomarkers. Furthermore, according to their tropism to certain target cells, EVs provide promising aspects to be used as drug delivery vehicles. Depending on their origin, certain EVs contain the potential to modulate physiological and pathophysiological processes. Although the EV field provides many interesting aspects, the methodology in EV research is limited. For now, EVs are mainly analyzed by nanoparticle tracking analysis and bulk molecular analysis, regularly Western Blot. These technologies cannot dissect the heterogeneity of EVs observed by electron microscopy (EM). Although EM technologies help to demonstrate the heterogeneity within EV samples, EM technologies are not appropriate to perform more complex and quantitative EV analyses. Flow cytometry (FCM) is a traditional method for dissecting the heterogeneity of given cell populations in a quantitative and complex manner. However, classical FCM regularly fails to detect objects in the size range of small EVs (sEVs) that typically is in the range between 70 and 150 nm. Recently, we and others demonstrated the potential of imaging FCM for the analyses of small EVs at the single vesicle level. Here, at the example of sEVs harvested from supernatants of human mesenchymal stromal cells (MSCs), we share a protocol for studying the expression of the tetraspanins CD9, CD63 and CD81 on single EVs.

Abstract Extracellular vesicles (EVs) are released from basically all cells. Over the last decade, small EVs (sEVs; 50–150 nm) have gained enormous attention in diagnostics and therapy. However, methodological limitations coupled to the lack of EV standards leave many questions in this quickly evolving field unresolved. Recently, by using enhanced green fluorescent protein (eGFP)‐labeled sEVs as biological reference material, we systematically optimized imaging flow cytometry for single sEV analysis. Furthermore, we showed that sEVs stained with different fluorescent antibodies can be analyzed in a multiparametric manner. However, many parameters potentially affecting the sEV staining procedure still require further evaluation and optimization. Here, we present a concise, systematic evaluation of the impact of the incubation temperature (4°C, room temperature and 37°C) during sEV antibody staining on the outcome of experiments involving the staining of EVs with fluorescence‐conjugated antibodies. We provide evidence that both the staining intensity and the sample recovery can vary depending on the incubation temperature applied, and that observed differences are less pronounced following prolonged incubation times. In addition, this study can serve as an application‐specific example of parameter evaluation in EV flow cytometry. © 2020 The Authors. Cytometry Part A published by Wiley Periodicals, Inc. on behalf of International Society for Advancement of Cytometry.

Abstract Extracellular vesicles (EVs) harvested from cell culture supernatants of human mesenchymal stromal cells (MSCs) suppress acute inflammation in preclinical models of various diseases. Furthermore, they promote regeneration of damaged tissues. Following successful clinical treatment of a steroid-refractory Graft-versus-Host-Disease (GvHD) patient with EVs prepared from conditioned media of human bone marrow (BM)-derived MSCs, we aim to improve MSC-EV production and quality control towards clinical application. Observing functional differences of independent MSC-EV preparations in vitro , we established an optimized murine GvHD model for the analysis of independent MSC-EV preparations in vivo . To this end, T cell depleted allogeneic BM cells co-transplanted with naïve allogeneic spleen-derived T cells induced GvHD symptoms with reproducible strengths in mice being preconditioned by ionizing irradiation. Administration of MSC-EV preparations with confirmed in vitro immune modulatory properties at three consecutive days significantly suppressed GvHD symptoms. In contrast, application of MSC-EV preparations lacking these in vitro immune modulating capabilities failed to suppress GvHD symptoms. Thus, our results reveal therapeutic differences among independent MSC-EV preparations that had been produced in a standardized manner. Thus, given this functional heterogeneity, any individual MSC-EV preparation considered for the clinical application should be evaluated for its potency prior to administration to patients.

Abstract Extracellular vesicles (EVs) from several body fluids, including urine, appear as promising biomarkers. Within the last decade, numerous groups have compared the efficacy of EV preparation protocols. Frequently, the efficacy of EV preparation methods is judged by the recovery of particles as estimated by conventional nanoparticle tracking analysis (NTA) or other particle quantification devices. Here, at the example of different urinary EV (uEV) preparation methods, we determined the particle yield in obtained samples with conventional NTA, analyzed their EV content by imaging flow cytometry (IFCM) and quantified the intensity of TSG101 and the contaminant protein uromodulin (UMOD) in Western blots. Our results demonstrate a correlation among CD9-positive objects detected by IFCM and TSG101 Western blot intensities, while particle numbers as determined by NTA correlated with the amount of UMOD. Consequently, our results question the reliability of conventional NTA analyses for identifying the optimal EV preparation method. Here, in our method comparison, a combination of size exclusion chromatography followed by ultra-filtration showed the highest CD9-positive object and TSG101 protein recovery, and in relation to the number of CD9-positive objects, the lowest amount of UMOD contamination.

Abstract Extracellular vesicles (EVs) are involved in mediating intercellular communication processes. An important goal within the EV field is the study of the biodistribution of EVs and the identification of their target cells. Considering that EV uptake is central for mediating the EVs role in intercellular communication processes, labelling with fluorescent dyes has emerged as a broadly distributed strategy for the identification of the EVs target cells and tissues. However, the accuracy and specificity of commonly utilized labelling dyes has not been sufficiently analyzed. By combining recent advancements in imaging flow cytometry for the phenotypic analysis of single EVs and aiming to identify target cells for EVs within therapeutically relevant MSC-EV preparations, we explored the EV labelling efficacy of various fluorescent dyes, specifically of CFDA-SE, Calcein AM, PKH67, BODIPY-TR-Ceramide and a novel lipid dye named Exoria. Our analyses qualified Exoria as the only dye which specifically labels EVs within our MSC-EV preparations. Furthermore, we demonstrate Exoria labelling does not interfere with the immunomodulatory properties of the MSC-EV preparations as tested in a multi-donor mixed lymphocyte reaction assay. Within this assay, labelled EVs were differentially taken-up by different immune cell types. Overall, our results qualify Exoria as an appropriate dye for the labelling of EVs derived from our MSC-EV preparations, this study also demonstrates the need for the development of next generation EV characterization tools which are able to localize and confirm specificity of EV labelling.

Abstract Mesenchymal stromal cells (MSCs) are promising regenerative therapeutics that primarily exert their effects through secreted extracellular vesicles (EVs). These EVs – being small and non‐living – are easier to handle and possess advantages over cellular products. Consequently, the therapeutic potential of MSC‐EVs is increasingly investigated. However, due to variations in MSC‐EV manufacturing strategies, MSC‐EV products should be considered as highly diverse. Moreover, the diverse array of EV characterisation technologies used for MSC‐EV characterisation further complicates reliable interlaboratory comparisons of published data. Consequently, this study aimed to establish a common method that can easily be used by various MSC‐EV researchers to characterise MSC‐EV preparations to facilitate interlaboratory comparisons. To this end, we conducted a comprehensive inter‐laboratory assessment using a novel multiplex bead‐based EV flow cytometry assay panel. This assessment involved 11 different MSC‐EV products from five laboratories with varying MSC sources, culture conditions, and EV preparation methods. Through this assay panel covering a range of mostly MSC‐related markers, we identified a set of cell surface markers consistently positive (CD44, CD73 and CD105) or negative (CD11b, CD45 and CD197) on EVs of all explored MSC‐EV preparations. Hierarchical clustering analysis revealed distinct surface marker profiles associated with specific preparation processes and laboratory conditions. We propose CD73, CD105 and CD44 as robust positive markers for minimally identifying MSC‐derived EVs and CD11b, CD14, CD19, CD45 and CD79 as reliable negative markers. Additionally, we highlight the influence of culture medium components, particularly human platelet lysate, on EV surface marker profiles, underscoring the influence of culture conditions on resulting EV products. This standardisable approach for MSC‐EV surface marker profiling offers a tool for routine characterisation of manufactured EV products in pre‐clinical and clinical research, enhances the quality control of MSC‐EV preparations, and hopefully paves the way for higher consistency and reproducibility in the emerging therapeutic MSC‐EV field.

Abstract Functional inhibitors of acid sphingomyelinase are clinically used as anti-depressants since ∼60 years. Here, we show that acid sphingomyelinase inhibition by the antidepressants amitriptyline, fluoxetine and desipramine protects from ischemia/reperfusion and elicits a profound brain remodeling response with increased angiogenesis, improved blood-brain barrier integrity, reduced brain leukocyte infiltration and increased neuronal survival. Angiogenesis is promoted by small extracellular vesicles with bona fide characteristics of exosomes, which are released from endothelial cells and which constitute an elegant target for the amplification of stroke recovery.