alpha-Synuclein is central in Parkinson's disease pathogenesis. Although initially alpha-synuclein was considered a purely intracellular protein, recent data suggest that it can be detected in the plasma and CSF of humans and in the culture media of neuronal cells. To address a role of secreted alpha-synuclein in neuronal homeostasis, we have generated wild-type alpha-synuclein and beta-galactosidase inducible SH-SY5Y cells. Soluble oligomeric and monomeric species of alpha-synuclein are readily detected in the conditioned media (CM) of these cells at concentrations similar to those observed in human CSF. We have found that, in this model, alpha-synuclein is secreted by externalized vesicles in a calcium-dependent manner. Electron microscopy and liquid chromatography-mass spectrometry proteomic analysis demonstrate that these vesicles have the characteristic hallmarks of exosomes, secreted intraluminar vesicles of multivesicular bodies. Application of CM containing secreted alpha-synuclein causes cell death of recipient neuronal cells, which can be reversed after alpha-synuclein immunodepletion from the CM. High- and low-molecular-weight alpha-synuclein species, isolated from this CM, significantly decrease cell viability. Importantly, treatment of the CM with oligomer-interfering compounds before application rescues the recipient neuronal cells from the observed toxicity. Our results show for the first time that cell-produced alpha-synuclein is secreted via an exosomal, calcium-dependent mechanism and suggest that alpha-synuclein secretion serves to amplify and propagate Parkinson's disease-related pathology.

Lung cancer in East Asia is characterized by a high percentage of never-smokers, early onset and predominant EGFR mutations. To illuminate the molecular phenotype of this demographically distinct disease, we performed a deep comprehensive proteogenomic study on a prospectively collected cohort in Taiwan, representing early stage, predominantly female, non-smoking lung adenocarcinoma. Integrated genomic, proteomic, and phosphoproteomic analysis delineated the demographically distinct molecular attributes and hallmarks of tumor progression. Mutational signature analysis revealed age- and gender-related mutagenesis mechanisms, characterized by high prevalence of APOBEC mutational signature in younger females and over-representation of environmental carcinogen-like mutational signatures in older females. A proteomics-informed classification distinguished the clinical characteristics of early stage patients with EGFR mutations. Furthermore, integrated protein network analysis revealed the cellular remodeling underpinning clinical trajectories and nominated candidate biomarkers for patient stratification and therapeutic intervention. This multi-omic molecular architecture may help develop strategies for management of early stage never-smoker lung adenocarcinoma.

Abstract Mutational signatures are imprints of pathophysiological processes arising through tumorigenesis. Here, we generate isogenic CRISPR-Cas9 knockouts (Δ) of 43 genes in human induced pluripotent stem cells, culture them in the absence of added DNA damage, and perform wholegenome sequencing of 173 daughter subclones. Δ OGG1 , Δ UNG , Δ EXO1 , Δ RNF168 , Δ MLH1 , Δ MSH2 , Δ MSH6 , Δ PMS1 , and Δ PMS2 produce marked mutational signatures indicative of being critical mitigators of endogenous DNA changes. Detailed analyses reveal that 8-oxo-dG removal by different repair proteins is sequence-context-specific while uracil clearance is sequencecontext-independent. Signatures of mismatch repair (MMR) deficiency show components of C>A transversions due to oxidative damage, T>C and C>T transitions due to differential misincorporation by replicative polymerases, and T>A transversions for which we propose a ‘reverse template slippage’ model. Δ MLH1 , Δ MSH6 , and Δ MSH2 signatures are similar to each other but distinct from Δ PMS2 . We validate these gene-specificities in cells from patients with Constitutive Mismatch Repair Deficiency Syndrome. Based on these experimental insights, we develop a classifier, MMRDetect, for improved clinical detection of MMR-deficient tumors.

Abstract Osteoarthritis causes pain and functional disability for a quarter of a billion people worldwide, with no disease-stratifying tools nor modifying therapy. Here, we use primary cartilage and synovium from osteoarthritis patients to construct a molecular quantitative trait locus map of gene expression and protein abundance. By integrating data across omics levels, we identify likely effector genes for osteoarthritis-associated genetic signals. We detect pronounced molecular differences between macroscopically intact and highly degenerated cartilage. We identify molecularly-defined patient subgroups that correlate with clinical characteristics, stratifying patients on the basis of their molecular profile. We construct and validate a 7-gene classifier that reproducibly distinguishes between these disease subtypes, and identify potentially actionable compounds for disease modification and drug repurposing.

Xeroderma pigmentosum (XP) is caused by defective nucleotide excision repair of DNA damage. This results in hypersensitivity to ultraviolet light and increased skin cancer risk, as sunlight-induced photoproducts remain unrepaired. However, many XP patients also display early-onset neurodegeneration, which leads to premature death. The mechanism of neurodegeneration is unknown. Here, we investigate XP neurodegeneration using pluripotent stem cells derived from XP patients and healthy relatives, performing functional multi-omics on samples during neuronal differentiation. We show substantially increased levels of 5′,8-cyclopurine and 8-oxopurine in XP neuronal DNA secondary to marked oxidative stress. Furthermore, we find that the endoplasmic reticulum stress response is upregulated and reversal of the mutant genotype is associated with phenotypic rescue. Critically, XP neurons exhibit inappropriate downregulation of the protein clearance ubiquitin-proteasome system (UPS). Chemical enhancement of UPS activity in XP neuronal models improves phenotypes, albeit inadequately. Although more work is required, this study presents insights with intervention potential.

Abstract YAP and TAZ are transcriptional co-activators that are often constitutively active in triple negative breast cancer (TNBC) cells driving proliferation, invasion, and drug resistance. Through multiplexed quantitative genetic screens for YAP/TAZ localisation and cell shape, we found that the RhoGEF DOCK5 is essential for YAP/TAZ activation in metastatic cells and is required for the maintenance of polarity during migration. DOCK5 regulates cell shape and thus YAP/TAZ through different genetic interactions with CDC42, RAC, and RHOA GTPases. DOCK5 regulates focal adhesion (FA) morphogenesis in RAC-dependent fashions that promote RHOA mediated actomyosin engagement of FA. Using unbiased systems-level quantification of protein levels by mass spectrometry we show that DOCK5 maintains polarity by stabilising protein levels of the CDC42 effector GSK3β. We conclude DOCK5 acts as a coincidence detector to promote leading edge persistence in subcellular locations where there is both RAC and RHOA dependent FA morphogenesis and active CDC42 mediated cell polarisation.

ABSTRACT Activation of client protein kinases by the HSP90 molecular chaperone system is affected by phosphorylation at multiple sites on HSP90, on the kinase specific co-chaperone CDC37, and the kinase client itself. Removal of regulatory phosphorylation from client kinases and their release from the HSP90-CDC37 system depends on a Ser/Thr phosphatase PP5, which associates with HSP90 via its N-terminal TPR domain. Here we present the cryoEM structure of the oncogenic protein kinase client BRAF V600E bound to HSP90-CDC37, showing how the V600E mutation favours BRAF association with HSP90-CDC37. Structures of HSP90-CDC37-BRAF V600E complexes with PP5, in autoinhibited and activated conformations, together with proteomic analysis of its phosphatase activity, reveal how PP5 is activated by recruitment to HSP90 complexes to comprehensively dephosphorylate client proteins.

Isobaric labelling is a highly precise approach for protein quantification. However, due to the isolation interference problem, isobaric tagging suffers from ratio underestimation at the MS2 level. The use of narrow isolation widths is a rational approach to alleviate the interference problem; however, this approach compromises proteome coverage. We reasoned that although a very narrow isolation window will result in loss of peptide fragment ions, the reporter ion signals will be retained for a significant portion of the spectra. Based on this assumption we have designed a Dual Isolation Width Acquisition (DIWA) method, in which each precursor is first fragmented with HCD using a standard isolation width for peptide identification and preliminary quantification, followed by a second MS2 HCD scan using a much narrower isolation width for the acquisition of quantitative spectra with reduced interference. We leverage the quantification obtained by the narrow scans to build linear regression models and apply these to decompress the fold-changes measured at the standard scans. We evaluate the DIWA approach using a nested two species/gene knockout TMT-6plex experimental design and discuss the perspectives of this approach.

The concentration of many transcription factors exhibit high cell-to-cell variability due to differences in synthesis, degradation, and cell size. Whether the functions of these factors are robust to fluctuations in...