Abstract Monitoring of marine protected areas (MPAs) is critical for marine ecosystem management, yet current protocols rely on SCUBA-based visual surveys that are costly and time consuming, limiting their scope and effectiveness. Environmental DNA (eDNA) metabarcoding is a promising alternative for marine ecosystem monitoring, but more direct comparisons to visual surveys are needed to understand the strengths and limitations of each approach. This study compares fish communities inside and outside the Scorpion State Marine Reserve off Santa Cruz Island, CA using eDNA metabarcoding and underwater visual census surveys. Results from eDNA captured 76% (19/25) of fish species and 95% (19/20) of fish genera observed during pairwise underwater visual census. Species missed by eDNA were due to the inability of MiFish 12S barcodes to differentiate species of rockfishes ( Sebastes , n=4) or low site occupancy rates of crevice-dwelling Lythrypnus gobies. However, eDNA detected an additional 30 fish species not recorded in paired visual surveys, but previously reported from prior visual surveys, highlighting the sensitivity of eDNA. Significant variation in eDNA signatures by location (50m) and site (~1000m) demonstrates the sensitivity of eDNA to address key questions such as community composition inside and outside MPAs. Interestingly, eDNA results recorded higher species richness outside the MPA while visual surveys observed the opposite pattern. This result is likely caused by swamping effects of high fish abundance in MPAs that reduce detection probabilities of pelagic and intertidal taxa. Results demonstrate the utility of eDNA metabarcoding for monitoring marine ecosystems, providing an important complementary tool to visual methods.

Abstract Unique ecosystems globally are under threat from ongoing anthropogenic environmental change. Effective conservation management requires more thorough biodiversity surveys that can reveal system-level patterns and that can be applied rapidly across space and time. We offer a way to use environmental DNA, community science and remote sensing together as methods to reduce the discrepancy between the magnitude of change and historical approaches to measure it. Taking advantages of modern ecological models, we integrate environmental DNA and Earth observations to evaluate regional biodiversity patterns for a snapshot of time, and provide critical community-level characterization. We collected 278 samples in Spring 2017 from coastal, shrub and lowland forest sites in California, a large-scale biodiversity hotspot. We applied gradient forest to model 915 family occurrences and community composition together with environmental variables and multi-scalar habitat classifications to produce a statewide biodiversity-based map. 16,118 taxonomic entries recovered were associated with environmental variables to test their predictive strength on alpha, beta, and zeta diversity. Local habitat classification was diagnostic of community composition, illuminating a characteristic of biodiversity hotspots. Using gradient forest models, environmental variables predicted 35% of the variance in eDNA patterns at the family level, with elevation, sand percentage, and greenness (NDVI32) as the top predictors. This predictive power was higher than we found in published literature at global scale. In addition to this indication of substantial environmental filtering, we also found a positive relationship between environmentally predicted families and their numbers of biotic interactions. In aggregate, these analyses showed that strong eDNA community-environment correlation is a general characteristic of temperate ecosystems, and may explain why communities easily destabilize under disturbances. Our study provides the first example of integrating citizen science based eDNA with biodiversity mapping across the tree of life, with promises to produce large scale, high resolution assessments that promote a more comprehensive and predictive understanding of the factors that influence biodiversity and enhance its maintenance.

Abstract Marine heatwaves can drive large-scale shifts in marine ecosystems but studying their impacts on whole species assemblages can be difficult. Here, we leverage the taxonomic breadth and resolution of DNA sequences derived from environmental DNA (eDNA) in the ethanol of a set of 23-year longitudinal ichthyoplankton samples, combining these with microscopy-derived ichthyoplankton identification to yield higher-resolution, species-specific quantitative abundance estimates of fish assemblages in the California Current Large Marine Ecosystem during and after the 2014–16 Pacific marine heatwave. This integrated dataset reveals patterns of tropicalization with increases in southern, mesopelagic species and associated declines in important temperate fisheries targets (e.g., North Pacific Hake ( Merluccius productus ) and Pacific Sardine ( Sardinops sagax )). We observed novel assemblages of southern, mesopelagic fishes and temperate species (e.g., Northern Anchovy, Engraulis mordax ) even after the return to average water temperatures. Our innovative preservative derived eDNA metabarcoding and quantitative modeling approaches open the door to reconstructing the historical dynamics of assemblages from modern and archived samples worldwide. Summary Novel quantitative abundance estimates from archived DNA reveals marine heatwave-associated shifts in fish assemblages.

Abstract Environmental DNA (eDNA) metabarcoding is an increasingly important tool for surveying biodiversity in marine ecosystems. However, the scale of temporal and spatial variability in eDNA signatures, and how this variation may impact eDNA-based marine biodiversity assessments, remains uncertain. To address this question, we systematically examined variation in vertebrate eDNA signatures across depth (0 m to 10 m) and horizontal space (nearshore and surf zone) over three successive days in a Southern California kelp forest. Across a broad range of marine vertebrates (teleosts, elasmobranchs, birds, and mammals), results showed significant variation in species richness and community assemblages across 4-5 m depth, reflecting microhabitat depth preferences of common Southern California nearshore rocky reef taxa. We also found significant differences in community assemblages between nearshore and surf zone sampling stations at the same depth, and across three sampling days. Patterns of microhabitat partitioning in eDNA signatures across space and time were largely consistent with known habitat preferences and species behavior. Results highlight the sensitivity of eDNA in capturing fine-scale vertical, horizontal, and temporal variation in marine vertebrate communities, demonstrating the ability of eDNA to capture a highly localized snapshot of marine biodiversity in dynamic coastal environments.

Abstract Correcting for amplification biases in genetic metabarcoding data can yield quantitative estimates of template DNA concentrations. However, a major source of uncertainty in metabarcoding data is the presence of non-detections, where a technical PCR replicate fails to detect a species observed in other replicates. Such non-detections are an important special case of variability among technical replicates in metabarcoding data, particularly in environmental samples. While many sampling and amplification processes underlie observed variation in metabarcoding data, understanding the causes of non-detections is an important step in distinguishing signal from noise in metabarcoding studies. Here, we use both simulated and empirical data to 1) develop a qualitative understanding of how non-detections arise in metabarcoding data, 2) outline steps to recognize uninformative data in practice, and 3) identify the conditions under which amplicon sequence data can reliably detect underlying biological signals. We show in both simulations and empirical data that, for a given species, the rate of non-detections among technical replicates is a function of both the template DNA concentration and species-specific amplification efficiency. Consequently, we conclude metabarcoding datasets are strongly affected by (1) deterministic amplification biases during PCR and (2) stochastic sampling of amplicons during sequencing — both of which we can model — but also by (3) stochastic sampling of rare molecules prior to PCR, which remains a frontier for quantitative metabarcoding. Our results highlight the importance of estimating species-specific amplification efficiencies and critically evaluating patterns of non-detection in metabarcoding datasets to better distinguish environmental signal from the noise inherent in molecular detections of rare targets.

Abstract Indonesia is the heart of the Coral Triangle, the world’s most diverse marine ecosystem. Preserving the biological and economic value of this marine biodiversity requires efficient and economical ecosystem monitoring, yet our understanding of marine biodiversity in this region remains limited. This study uses environmental DNA (eDNA) to survey fish communities across a pronounced biodiversity gradient in Indonesia. A total of 12,939,690 sequence reads of MiFish 12S rRNA from 39 sites spanning 7 regions of Indonesia revealed 4,146 Amplified Sequence Variants (ASVs). Regional patterns of fish diversity based on eDNA broadly conformed to expectations based on traditional biodiversity survey methods, with the highest fish biodiversity in Raja Ampat and generally lower diversity in Western Indonesia. However, eDNA performed relatively poorly compared to visual survey methods in site-by-site comparisons, both in terms of total number of taxa recovered and ability to assign species names to ASVs. This result stands in a stark contrast to eDNA studies of temperate and tropical ecosystems with lower diversity. Analyses show that while sequencing depth was sufficient to capture all fish diversity within individual seawater samples, variation among samples from individual localities was high, and sampling effort was insufficient to capture all fish diversity at a given sampling site. Interestingly, mean ASVs recovered per one-liter seawater was surprisingly similar across sites, despite substantial differences in total diversity, suggesting a limit to total ASVs (~200) per one-liter eDNA sample. Combined, results highlight two major challenges of eDNA in highly diverse ecosystems such as the Coral Triangle. First, reference databases are incomplete and insufficient for effective ASV taxonomic assignment. Second, eDNA sampling design developed from lower diversity temperate marine ecosystems are inadequate to fully capture diversity of biodiversity hotspots like the Coral Triangle.

Abstract Key to making accurate taxonomic assignments are curated, comprehensive reference barcode databases. However, the generation and curation of such databases has remained challenging given the large and continuously growing volumes of DNA sequence data and novel reference barcode targets. Monitoring and research applications require a greater diversity of specialized gene regions and targeted taxa to meet taxonomic classification goals then are currently curated by professional staff. Thus, there is a growing need for an easy to implement tool that can generate comprehensive metabarcoding reference libraries for any bespoke locus. We address this need by reimagining CRUX from the Anacapa Toolkit and present the rCRUX package in R. The typical workflow involves searching for plausible seed amplicons ( get_seeds_local () or get_seeds_remote ()) by simulating in silico PCR to acquire seed sequences containing a user-defined primer set. Next these seeds are used to iteratively blast search seed sequences against a local NCBI formatted database using a taxonomic rank based stratified random sampling approach ( blast_seeds ()) that results in a comprehensive set of sequence matches. This database is dereplicated and cleaned ( derep_and_clean_db ()) by identifying identical reference sequences and collapsing the taxonomic path to the lowest taxonomic agreement across all matching reads. This results in a curated, comprehensive database of primer specific reference barcode sequences from NCBI. We demonstrate that rCRUX provides more comprehensive reference databases for the MiFish Universal Teleost 12S, Taberlet trnl, and fungal ITS locus than CRABS, METACURATOR, RESCRIPt, and ECOPCR reference databases. We then further demonstrate the utility of rCRUX by generating 16 reference databases for metabarcoding loci that lack dedicated reference database curation efforts. The rCRUX package provides a simple to use tool for the generation of curated, comprehensive reference databases for user-defined loci, facilitating accurate and effective taxonomic classification of metabarcoding and DNA sequence efforts broadly.

Abstract Environmental DNA (eDNA) is increasingly used to measure biodiversity of marine ecosystems. However, key aspects of spatial and temporal dynamics of eDNA remain unknown. Particularly, it is unclear how long eDNA signals persist locally in dynamic marine environments, since degradation rates have predominantly been quantified through mesocosm studies. To determine in situ eDNA residence times, we introduced an eDNA signal from a non-native fish into a Southern California rocky reef ecosystem, and then measured changes in both introduced and background eDNA signals over 96 hours. Foreign eDNA signal could no longer be detected 7.5 hours after introduction, far exceeding disappearance rates quantified in laboratory studies. In addition, native vertebrate eDNA signals varied greatly over the 96 hours of observation, but time of day and tidal direction did not drive this variation in community structure. Species accumulation curves showed that standard sampling protocols using 3 replicate 1 L sea water samples were insufficient to capture full diversity of local marine vertebrates, capturing only 76% of all taxa. Despite this limitation, a single eDNA sample captured greater vertbrate diversity than 18 SCUBA based underwater visual transect surveys conducted at a nearby site. There was no significant difference in species richness between temporal replicates and spatial replicates, suggesting a space for time substitution may be effective for fully capturing the diversity of local marine vertebrate communities in nearshore rocky reef environments. This result is particularly important in designing eDNA metabarcoding sampling protocols to capture local marine species diversity.

Abstract Surf zones are highly dynamic marine ecosystems that are subject to increasing anthropogenic and climatic pressures, posing multiple challenges for biomonitoring. Traditional methods such as seines and hook and line surveys are often labor intensive, taxonomically biased, and can be physically hazardous. Emerging techniques, such as baited remote underwater video (BRUV) and environmental DNA (eDNA) are promising nondestructive tools for assessing marine biodiversity in surf zones of sandy beaches. Here we compare the relative performance of beach seines, BRUV, and eDNA in characterizing community composition of bony (teleost) and cartilaginous (elasmobranch) fishes of surf zones at 18 open coast sandy beaches in southern California. Seine and BRUV surveys captured overlapping, but distinct fish communities with 50% (18/36) of detected species shared. BRUV surveys more frequently detected larger species (e.g. sharks and rays) while seines more frequently detected one of the most abundant species, barred surfperch ( Amphistichus argenteus ). In contrast, eDNA metabarcoding captured 83.3% (30/36) of all fishes observed in seine and BRUV surveys plus 59 additional species, including 13 that frequent surf zone habitats. eDNA approaches showed significantly higher sensitivity than seine and BRUV methods and more consistently detected 29 of the 30 (96.7%) jointly observed species across beaches. The six species detected by BRUV/seines, but not eDNA either lacked reference sequences, were only resolved at higher taxonomic ranks (e.g. Embiotocidae surfperches), or were detected below occupancy thresholds. Low site-species overlap between methods limited comparisons of richness and abundance estimates, highlighting the challenge of comparing biomonitoring approaches. Despite potential for improvement, results overall demonstrate that eDNA can provide a cost-effective tool for long-term surf zone monitoring that complements data from seine and BRUV surveys, allowing more comprehensive surveys of vertebrate diversity in surf zone habitats.

Abstract Seagrass beds are disappearing at a record pace despite their known value to our oceans and coastal communities. Simultaneously, our coastlines are under the constant pressure of climate change which is impacting their chemical, physical and biological characteristics. It is thus pertinent to evaluate and record habitat use so we can understand how these changes are affecting biodiversity over time. This study evaluates the assemblages of fish found at five Zostera beds in Southern California using environmental DNA (eDNA) metabarcoding. eDNA is a powerful biodiversity monitoring tool that offers key advantages to conventional monitoring. Results from our eDNA study found 78 species of fish that inhabit these five beds around Southern California representing embayment, open coastal mainland and open coastal island settings. While each bed had the same average number of species found throughout the year, the composition of these fish assemblages was strongly site dependent. There were 35 fish that were found at both open coast and embayment seagrass beds, while embayment seagrass sites had 20 unique fish and open coast sites had 23 unique fish. These results demonstrate that seagrass fish assemblages are heterogenous based on their geographic positioning and that marine managers must take this into account for holistic conservation and restoration efforts.