The evolutionary features of clear-cell renal cell carcinoma (ccRCC) have not been systematically studied to date. We analyzed 1,206 primary tumor regions from 101 patients recruited into the multi-center prospective study, TRACERx Renal. We observe up to 30 driver events per tumor and show that subclonal diversification is associated with known prognostic parameters. By resolving the patterns of driver event ordering, co-occurrence, and mutual exclusivity at clone level, we show the deterministic nature of clonal evolution. ccRCC can be grouped into seven evolutionary subtypes, ranging from tumors characterized by early fixation of multiple mutational and copy number drivers and rapid metastases to highly branched tumors with >10 subclonal drivers and extensive parallel evolution associated with attenuated progression. We identify genetic diversity and chromosomal complexity as determinants of patient outcome. Our insights reconcile the variable clinical behavior of ccRCC and suggest evolutionary potential as a biomarker for both intervention and surveillance.

The immune microenvironment influences tumour evolution and can be both prognostic and predict response to immunotherapy1,2. However, measurements of tumour infiltrating lymphocytes (TILs) are limited by a shortage of appropriate data. Whole-exome sequencing (WES) of DNA is frequently performed to calculate tumour mutational burden and identify actionable mutations. Here we develop T cell exome TREC tool (T cell ExTRECT), a method for estimation of T cell fraction from WES samples using a signal from T cell receptor excision circle (TREC) loss during V(D)J recombination of the T cell receptor-α gene (TCRA (also known as TRA)). TCRA T cell fraction correlates with orthogonal TIL estimates and is agnostic to sample type. Blood TCRA T cell fraction is higher in females than in males and correlates with both tumour immune infiltrate and presence of bacterial sequencing reads. Tumour TCRA T cell fraction is prognostic in lung adenocarcinoma. Using a meta-analysis of tumours treated with immunotherapy, we show that tumour TCRA T cell fraction predicts immunotherapy response, providing value beyond measuring tumour mutational burden. Applying T cell ExTRECT to a multi-sample pan-cancer cohort reveals a high diversity of the degree of immune infiltration within tumours. Subclonal loss of 12q24.31–32, encompassing SPPL3, is associated with reduced TCRA T cell fraction. T cell ExTRECT provides a cost-effective technique to characterize immune infiltrate alongside somatic changes. A robust, cost-effective technique based on whole-exome sequencing data can be used to characterize immune infiltrates, relate the extent of these infiltrates to somatic changes in tumours, and enables prediction of tumour responses to immune checkpoint inhibition therapy.

Abstract Projection neurons (PNs) in the mammalian olfactory bulb (OB) receive direct input from the nose and project to diverse cortical and subcortical areas. Morphological and physiological studies have highlighted functional heterogeneity, yet no molecular markers have been described that delineate PN subtypes. Here, we used viral injections into olfactory cortex and fluorescent nucleus sorting to enrich PNs for high-throughput single nucleus and bulk RNA deep sequencing. Transcriptome analysis and RNA in situ hybridization identified three mitral and five tufted cell populations with characteristic transcription factor network topology and cell adhesion and excitability-related gene expression. Finally, by integrating bulk and snRNA-seq data we propose that different mitral cell populations selectively project to different regions of olfactory cortex. Together, we have identified potential molecular and gene regulatory mechanisms underlying PN diversity and provide new molecular entry points into studying the diverse functional roles of mitral and tufted cell subtypes.

ABSTRACT Germinal centers (GCs) require sustained availability of antigens to promote antibody affinity maturation against pathogens and vaccines. A key source of antigens for GC B cells are immune complexes (ICs) displayed on follicular dendritic cells (FDCs). Here we show that FDC spatial organization regulates antigen dynamics in the GC. We show the existence of two light zone (LZ) FDC populations, which differ in the duration of antigen retention. While the entire light zone (LZ) FDC network captures ICs initially, only the central cells of the network function as a long-term antigen reservoir, where different antigens arriving from subsequent immunizations co-localize. Mechanistically, central FDCs constitutively express subtly higher CR2 membrane densities than peripheral FDCs, which strongly increases the IC retention half-life. Even though repeated immunizations gradually saturate central FDCs, B cell responses remain efficient because new antigens partially displace old ones. These results reveal the principles shaping antigen display on FDCs during the GC reaction.

Abstract The phenomenon of mixed/heterogenous treatment responses to cancer therapies within an individual patient presents a challenging clinical scenario. Furthermore, the molecular basis of mixed intra-patient tumor responses remains unclear. Here, we show that patients with metastatic lung adenocarcinoma harbouring co-mutations of EGFR and TP53 , are more likely to have mixed intra-patient tumor responses to EGFR tyrosine kinase inhibition (TKI), compared to those with an EGFR mutation alone. The combined presence of whole genome doubling (WGD) and TP53 co-mutations leads to increased genome instability and genomic copy number aberrations in genes implicated in EGFR TKI resistance. Using mouse models and an in vitro isogenic p53 -mutant model system, we provide evidence that WGD provides diverse routes to drug resistance by increasing the probability of acquiring copy-number gains or losses relative to non-WGD cells. These data provide a molecular basis for mixed tumor responses to targeted therapy, within an individual patient, with implications for therapeutic strategies.

Abstract How neurogenesis and gliogenesis are coordinated during development and why mature glial cells often share properties with neuroectodermal progenitors remains unclear. Here, we have used single cell RNA sequencing to map the regulatory landscape of neuronal and glial differentiation in the mammalian enteric nervous system (ENS). Our analysis indicates that neurogenic trajectories branch directly from a linear gliogenic axis defined by autonomic neural crest cells adopting sequential states as they progressively lose their strong neurogenic bias and acquire properties of adult enteric glia. We identify gene modules associated with transcriptional programs driving enteric neurogenesis and cell state transitions along the gliogenic axis. By comparing the chromatin accessibility profile of autonomic neural crest and adult enteric glia we provide evidence that the latter maintain an epigenetic memory of their neurogenic past. Finally, we demonstrate that adult enteric glia maintain neurogenic potential and are capable of generating enteric neurons in certain contexts by activating transcriptional programs employed by early ENS progenitors. Our studies uncover a novel configuration of enteric neurogenesis and gliogenesis that enables the coordinate development of ENS lineages and provides a mechanistic explanation for the ability of enteric glia to be functionally integrated into the adult intestine and simultaneously maintain attributes of early ENS progenitors.

Patient-derived xenograft (PDX) models are widely used in cancer research. To investigate the genomic fidelity of non-small cell lung cancer PDX models, we established 48 PDX models from 22 patients enrolled in the TRACERx study. Multi-region tumor sampling increased successful PDX engraftment and most models were histologically similar to their parent tumor. Whole-exome sequencing enabled comparison of tumors and PDX models and we provide an adapted mouse reference genome for improved removal of NOD scid gamma (NSG) mouse-derived reads from sequencing data. PDX model establishment caused a genomic bottleneck, with models often representing a single tumor subclone. While distinct tumor subclones were represented in independent models from the same tumor, individual PDX models did not fully recapitulate intratumor heterogeneity. On-going genomic evolution in mice contributed modestly to the genomic distance between tumors and PDX models. Our study highlights the importance of considering primary tumor heterogeneity when using PDX models and emphasizes the benefit of comprehensive tumor sampling.

Summary The mechanisms regulating immune dysfunction during sepsis are poorly understood. Here, we show that neutrophil-derived myeloperoxidase delays the onset of immune dysfunction during systemic candidiasis by controlling microbes captured by splenic marginal zone (MZ) macrophages. In contrast, SIGNR1-mediated microbe capture accelerates MZ colonization and immune dysfunction by triggering T cell death, T cell-dependent chromatin release and the synergistic induction of G-CSF by histones and fungi. Histones and G-CSF promote the prevalence of immature Ly6G low neutrophils with defective oxidative burst, by selectively shortening the lifespan of mature Ly6G high neutrophils. Consistently, T cell deficiency, or blocking SIGNR1, G-CSF or histones delayed neutrophil dysfunction. Furthermore, histones and G-CSF in the plasma of sepsis patients, shortened neutrophil lifespan and correlated with neutrophil mortality markers associated with a poor prognosis. Hence, the compromise of internal antimicrobial barrier sites drives neutrophil dysfunction by selectively modulating neutrophil lifespan via pathogenic T cell death, extracellular histones, and G-CSF.

Primordial follicles are quiescent ovarian structures comprised of a single oocyte surrounded by a layer of somatic supporting pregranulosa cells. Primordial follicle activation is the first step towards oocyte maturation and, ultimately, ovulation. As there is a finite number of ovarian follicles within the ovary, their rate of activation is a critical parameter of the female reproductive lifespan. Follicle activation is characterised by morphological and molecular changes in both pregranulosa cells and oocytes. However, the signal initiating activation, and even the cell-type responding to this signal, remain unidentified. Through single-cell transcriptomic profiling of neonatal mouse ovaries we identify a putative gene expression signature of activating pregranulosa cells. We find precocious expression of this putative pregranulosa cell signature in the Cdkn1b-/- or p27kip1-null model, which has ubiquitous follicle activation neonatally. We confirm that the protein product of one of these genes, Tnni3, is present within mouse granulosa cells, which has also been described recently for human granulosa cells. We demonstrate that expression of cardiac troponin I (TNNI3), an actin-binding protein, is upregulated upon cell-cycle resumption in activating pregranulosa cells. This indicates pregranulosa cells likely initiate primordial follicle activation and support the broader hypothesis that changes in cell tension are involved in triggering follicle activation.

Abstract Current knowledge of the transcriptional regulation of human pluripotency is incomplete, with lack of inter-species conservation observed. Single-cell transcriptomics of human embryos previously enabled us to identify transcription factors, including the zinc-finger protein KLF17, that are enriched in the human epiblast and naïve hESCs. Here we show that KLF17 is expressed coincident with the known pluripotency factors NANOG and SOX2 across human blastocyst development. We investigate the function of KLF17 in pluripotency using primed and naïve hESCs for gain- and loss-of-function analyses. We find that ectopic expression of KLF17 in primed hESCs is sufficient to induce a naïve-like transcriptome and that KLF17 can drive transgene-mediated resetting to naïve pluripotency. This implies a role for KLF17 in establishing naïve pluripotency. However, CRISPR-Cas9-mediated knockout studies reveal that KLF17 is not required for naïve pluripotency acquisition in vitro . Transcriptome analysis of naïve hESCs identifies subtle effects on metabolism and signalling following KLF17 loss of function, and possible redundancy with the related factor, KLF5. Overall, we show that KLF17 is sufficient, but not necessary, for naïve pluripotency under the given in vitro conditions. Summary statement Investigating KLF17 in human pluripotency reveals that it is sufficient, but not necessary, to establish naïve hESCs. We posit that KLF17 is a peripheral regulator, like KLF2 in the mouse.