•DNA barcoding is facing many challenges as it incorporates new technological advances. •DNA barcoding and metabarcoding are highly complementary approaches. •We need a coordinated advancement of DNA-based species identification. •We need to unify traditional taxonomy, barcoding, and metabarcoding approaches. DNA-based species identification, known as barcoding, transformed the traditional approach to the study of biodiversity science. The field is transitioning from barcoding individuals to metabarcoding communities. This revolution involves new sequencing technologies, bioinformatics pipelines, computational infrastructure, and experimental designs. In this dynamic genomics landscape, metabarcoding studies remain insular and biodiversity estimates depend on the particular methods used. In this opinion article, I discuss the need for a coordinated advancement of DNA-based species identification that integrates taxonomic and barcoding information. Such an approach would facilitate access to almost 3 centuries of taxonomic knowledge and 1 decade of building repository barcodes. Conservation projects are time sensitive, research funding is becoming restricted, and informed decisions depend on our ability to embrace integrative approaches to biodiversity science. DNA-based species identification, known as barcoding, transformed the traditional approach to the study of biodiversity science. The field is transitioning from barcoding individuals to metabarcoding communities. This revolution involves new sequencing technologies, bioinformatics pipelines, computational infrastructure, and experimental designs. In this dynamic genomics landscape, metabarcoding studies remain insular and biodiversity estimates depend on the particular methods used. In this opinion article, I discuss the need for a coordinated advancement of DNA-based species identification that integrates taxonomic and barcoding information. Such an approach would facilitate access to almost 3 centuries of taxonomic knowledge and 1 decade of building repository barcodes. Conservation projects are time sensitive, research funding is becoming restricted, and informed decisions depend on our ability to embrace integrative approaches to biodiversity science.

Abstract To safeguard biodiversity in a changing climate, we require taxonomic information about species turnover and insights into the health of organisms. Environmental DNA approaches are increasingly used for species identification, but cannot provide functional insights. Transcriptomic methods reveal the physiological states of macroorganisms, but are currently species specific and require tissue sampling or animal sacrifice, making community-wide assessments challenging. Here, we test if broad functional information (expression level of the transcribed genes) can be harnessed from environmental RNA (eRNA), which includes extra-organismal RNA from macroorganisms along with whole microorganisms. We exposed Daphnia pulex as well as phytoplankton prey and microorganism colonizers to control (20 °C) and heat stress (28 °C) conditions for seven days. We sequenced eRNA from tank water (after complete removal of Daphnia ) as well as RNA from Daphnia tissue, enabling comparisons of extra-organismal and organismal RNA based gene expression profiles. Both RNA types detected similar heat stress responses of Daphnia . Using eRNA, we identified 32 Daphnia genes to be differentially expressed following heat stress. Of these, 17 were also differentially expressed and exhibited similar levels of relative expression in organismal RNA. In addition to the extra-organismal Daphnia response, eRNA detected community-wide heat stress responses consisting of distinct functional profiles and 121 differentially expressed genes across 8 taxa. Our study demonstrates that environmental transcriptomics based on eRNA can non-invasively reveal gene expression responses of macroorganisms following environmental changes, with broad potential implications for the biomonitoring of ecological health across the trophic chain.

Abstract Summary Amplicons to Global Gene ( A 2 G 2 ) is a Python wrapper that uses MAFFT and an “Amplicon to Gene” strategy to align very large numbers of sequences while improving alignment accuracy. It is specially developed to deal with conserved genes, where traditional aligners introduce a significant amount of gaps. A 2 G 2 leverages the add sequences option of MAFFT to align the sequences to a global reference gene and a local reference region. Both of these references can be consensus sequences of trusted sources. Efficient parallelization of these tasks allows A 2 G 2 to align a very large number of sequences (> 500K) in a reasonable amount of time. A 2 G 2 can be imported in Python for easier integration with other software, or can be run via command line. Availability A 2 G 2 is implemented in Python 3 (3.6) and depends on MAFFT availability. Other package requirements can be found in the requirements.txt file at https://github.com/jshleap/A2G . A 2 G 2 is also available via PyPi ( https://pypi.org/project/A2G ). It is licensed under the LGPLv3. Supplementary information Supplementary material is available at github as jupyter notebook.

Abstract Ecosystems are connected by flows of nutrients and organisms. Changes to connectivity and nutrient enrichment may destabilise ecosystem dynamics far from the nutrient source. We used gradostats to examine the effects of trophic connectivity (movement of consumers and producers) versus nutrient-only connectivity in different metaecosystem configurations (linear vs dendritic) on dynamics of Daphnia pulex (consumers) and an algae (resources). We found that peak population size and instability (coefficient of variation; CV) of Daphnia populations increased as distance from the nutrient input increased, but were lower in metaecosystems connected by all trophic levels compared to nutrient-only connected systems and in dendritic systems compared to linear ones. We examined the effects of trophic connectivity (i.e. how many trophic levels are moving rather than one or the other) using a generic model to qualitatively assess patterns of ecosystem dynamics. Our model predicted increased population sizes and fluctuations in ecosystems with nutrient connectivity, with this pattern being more pronounced in linear rather than dendritic systems. These results confirm that connectivity may propagate and even amplify instability over a metaecosystem to communities far from the source disturbance, and suggest a pathway for future experiments, that recreate conditions closer to those found in natural systems.

Abstract Aquatic ecosystems offer a continuum of water flow from headwater streams to inland lakes and coastal marine systems. This spatial connectivity influences the structure, function and dynamics of aquatic communities, which are among the most threatened and degraded on earth. Environmental DNA achieves biodiversity surveys in these habitats in a high-throughput, spatially integrated way. Here, we determine the spatial resolution of eDNA in dendritic freshwater networks that are typical of aquatic habitats. Our intensive sampling campaign comprised over 430 eDNA samples across 21 connected lakes, allowing us to analyse detections at a variety of scales, from different habitats within a lake to entire lake networks. We found strong signals of within-lake variation in eDNA distribution reflective of typical habitat use by both fish and zooplankton. Most importantly, we also found that connecting channels between lakes resulted in an accumulation of downstream eDNA detections in lakes with a higher number of inflows, and as networks increased in length. These findings have profound implications for the interpretation of eDNA detections in aquatic ecosystems in global-scale biodiversity monitoring observations.

Abstract Molecular genetic approaches applied to environmental DNA have great potential for biodiversity research and ecosystem monitoring. A metagenome contains genetic information from all organisms captured in an environmental sample. It has been primarily used to study bacteria and archaea, but promising reports focusing on metazoan diversity are emerging. However, methodological uncertainties remain, and studies are required to validate the power and the limitations of such an approach when applied to macro-eukaryotes. Here, we analyzed water sample metagenomes to estimate zooplankton diversity in 22 freshwater lakes across Eastern Canada. We tested the coherence of data based on morphologically identified zooplankton taxa and molecular genetic data derived from shotgun sequencing of environmental DNA collected at the same time. RV coefficients showed a significant correlation between the relative abundance of zooplankton families derived from small subunit rRNA genes extracted from the metagenomes and morphologically identified zooplankton. However, differences in congruence with morphological counts were detected when varied bioinformatic approaches were applied to presence-absence data. This study presents one of the first diversity assessments of a group of aquatic metazoans using metagenomes and validates the coherence of the community composition derived from genetic and classical species surveys. Overall, our results suggest that metagenomics has the potential to be further developed to describe metazoan biodiversity in aquatic ecosystems, and to advance this area we provide key recommendations for workflow improvement.

Abstract Nucleic acids released by organisms and isolated from environmental substrates are increasingly being used for molecular biomonitoring. While environmental DNA (eDNA) has received attention recently, the potential of environmental RNA as a biomonitoring tool remains less explored. Several recent studies using paired DNA and RNA metabarcoding of bulk samples suggest that RNA might better reflect “metabolically active” parts of the community. However, such studies mainly capture organismal eDNA and eRNA. For larger eukaryotes, isolation of extra-organismal RNA will be important, but viability needs to be examined in a field-based setting. In this study we evaluate (a) whether extra-organismal eRNA release from macroeukaryotes can be detected given its supposedly rapid degradation, and (b) if the same field collection methods for eDNA can be applied to eRNA. We collected eDNA and eRNA from water in lakes where fish community composition is well documented, enabling a comparison between the two nucleic acids in two different seasons with monitoring using conventional methods. We found that eRNA is released from macroeukaryotes and can be filtered from water and metabarcoded in a similar manner as eDNA to reliably provide species composition information. eRNA had a small but significantly greater true positive rate than eDNA, indicating that it correctly detects more species known to exist in the lakes. Given relatively small differences between the two molecules in describing fish community composition, we conclude that if eRNA provides significant advantages in terms of lability, it is a strong candidate to add to the suite of molecular monitoring tools.

Mutation rate variation has been under intense investigation for decades. Despite these efforts, little is known about the extent to which environmental stressors accelerate mutation rates and influence the genetic load of populations. Moreover, most studies have focused on point mutations rather than large-scale deletions and duplications (copy number variations or "CNVs"). We estimated mutation rates in Daphnia pulex exposed to low levels of environmental stressors as well as the effect of selection on de novo mutations. We conducted a mutation accumulation (MA) experiment in which selection was minimized, coupled with an experiment in which a population was propagated under competitive conditions in a benign environment. After an average of 103 generations of MA propagation, we sequenced 60 genomes and found significantly accelerated rates of deletions and duplications in MA lines exposed to ecologically relevant concentrations of metals. Whereas control lines had gene deletion and duplication rates comparable to other multicellular eukaryotes (1.8 × 10-6 per gene per generation), a mixture of nickel and copper increased rates fourfold. The realized mutation rate under selection was reduced to 0.4x that of control MA lines, providing evidence that CNVs contribute to mutational load. Our CNV breakpoint analysis revealed that nonhomologous recombination associated with regions of DNA fragility is the primary source of CNVs, plausibly linking metal-induced DNA strand breaks with higher CNV rates. Our findings suggest that environmental stress, in particular multiple stressors, can have profound effects on large-scale mutation rates and mutational load of populations.

Organism abundance is a critical parameter in ecology, but its estimation is often challenging. Approaches utilizing eDNA to indirectly estimate abundance have recently generated substantial interest. However, preliminary correlations observed between eDNA concentration and abundance in nature are typically moderate in strength with significant unexplained variation. Here we apply a novel approach to integrate allometric scaling coefficients into models of eDNA concentration and organism abundance. We hypothesize that eDNA particle production scales non-linearly with mass, with scaling coefficients < 1. Wild populations often exhibit substantial variation in individual body size distributions; we therefore predict that the distribution of mass across individuals within a population will influence population-level eDNA production rates. To test our hypothesis, we collected standardized body size distribution and mark-recapture abundance data using whole-lake experiments involving nine populations of brook trout. We correlated eDNA concentration with three metrics of abundance: density (individuals/ha), biomass (kg/ha), and allometrically scaled mass (ASM) (∑(individual mass0.73)/ha). Density and biomass were both significantly positively correlated with eDNA concentration (adj. R2 = 0.59 and 0.63, respectively), but ASM exhibited improved model fit (adj. R2 = 0.78). We also demonstrate how estimates of ASM derived from eDNA samples in ‘unknown’ systems can be converted to biomass or density estimates with additional size structure data. Future experiments should empirically validate allometric scaling coefficients for eDNA production, particularly where substantial intraspecific size distribution variation exists. Incorporating allometric scaling may improve predictive models to the extent that eDNA concentration may become a reliable indicator of abundance in nature.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

A long-standing evolutionary puzzle is that all eukaryotic genomes contain large amounts of tandemly-repeated satellite DNA whose composition varies greatly among even closely related species. To elucidate the evolutionary forces governing satellite dynamics, quantification of the rates and patterns of mutations in satellite DNA copy number and tests of its selective neutrality are necessary. Here we used whole-genome sequences of 28 mutation accumulation (MA) lines of Daphnia pulex in addition to six isolates from a non-MA population originating from the same progenitor to both estimate mutation rates of abundances of satellite sequences and evaluate the selective regime acting upon them. We found that mutation rates of individual satellite sequence “kmers” were both high and highly variable, ranging from additions/deletions of 0.29 – 105 copies per generation (reflecting changes of 0.12 - 0.80 percent per generation). Our results also provide evidence that new kmer sequences are often formed from existing ones. The non-MA population isolates showed a signal of either purifying or stabilizing selection, with 33 % lower variation in kmer abundance on average than the MA lines, although the level of selective constraint was not evenly distributed across all kmers. The changes between many pairs of kmers were correlated, and the pattern of correlations was significantly different between the MA lines and the non-MA population. Our study demonstrates that kmer sequences can experience extremely rapid evolution in abundance, which can lead to high levels of divergence in genome-wide satellite DNA composition between closely related species.