The role of historical contingency in evolution has been much debated, but rarely tested. Twelve initially identical populations of Escherichia coli were founded in 1988 to investigate this issue. They have since evolved in a glucose-limited medium that also contains citrate, which E. coli cannot use as a carbon source under oxic conditions. No population evolved the capacity to exploit citrate for >30,000 generations, although each population tested billions of mutations. A citrate-using (Cit + ) variant finally evolved in one population by 31,500 generations, causing an increase in population size and diversity. The long-delayed and unique evolution of this function might indicate the involvement of some extremely rare mutation. Alternately, it may involve an ordinary mutation, but one whose physical occurrence or phenotypic expression is contingent on prior mutations in that population. We tested these hypotheses in experiments that “replayed” evolution from different points in that population's history. We observed no Cit + mutants among 8.4 × 10 12 ancestral cells, nor among 9 × 10 12 cells from 60 clones sampled in the first 15,000 generations. However, we observed a significantly greater tendency for later clones to evolve Cit + , indicating that some potentiating mutation arose by 20,000 generations. This potentiating change increased the mutation rate to Cit + but did not cause generalized hypermutability. Thus, the evolution of this phenotype was contingent on the particular history of that population. More generally, we suggest that historical contingency is especially important when it facilitates the evolution of key innovations that are not easily evolved by gradual, cumulative selection.

Evolutionary novelties have been important in the history of life, but their origins are usually difficult to examine in detail. We previously described the evolution of a novel trait, aerobic citrate utilization (Cit+), in an experimental population of Escherichia coli. Here we analyse genome sequences to investigate the history and genetic basis of this trait. At least three distinct clades coexisted for more than 10,000 generations before its emergence. The Cit+ trait originated in one clade by a tandem duplication that captured an aerobically expressed promoter for the expression of a previously silent citrate transporter. The clades varied in their propensity to evolve this novel trait, although genotypes able to do so existed in all three clades, implying that multiple potentiating mutations arose during the population’s history. Our findings illustrate the importance of promoter capture and altered gene regulation in mediating the exaptation events that often underlie evolutionary innovations. By combining full-genome sequencing and ‘evolutionary replay’ experiments to dissect the origin of aerobic citrate use in an experimental Escherichia coli population over 40,000 generations and 2 decades, the authors unveil a 3-step process in which potentiation makes a trait possible, actualization makes the trait manifest and refinement makes it effective. It has been suggested that small evolutionary steps pave the way for more major evolutionary leaps — in a combination of Darwinian gradualism and saltationism — but mechanistic details have been hard to determine from natural history. Rich Lenski and colleagues have now combined full-genome sequencing and 'evolutionary replay' experiments to dissect the multi-step origin of one key innovation — the evolution of aerobic citrate-utilization in an experimental bacterial population — over more than 30,000 generations and two decades. The three-step process they unveil, in which potentiation makes a trait possible, actualization makes it manifest and refinement makes it effective, is likely to be typical of other biological revolutions such as the colonization of land by proto-tetrapods.

Many populations live in environments subject to frequent biotic and abiotic changes. Nonetheless, it is interesting to ask whether an evolving population's mean fitness can increase indefinitely, and potentially without any limit, even in a constant environment. A recent study showed that fitness trajectories of Escherichia coli populations over 50,000 generations were better described by a power-law model than by a hyperbolic model. According to the power-law model, the rate of fitness gain declines over time but fitness has no upper limit, whereas the hyperbolic model implies a hard limit. Here, we examine whether the previously estimated power-law model predicts the fitness trajectory for an additional 10,000 generations. To that end, we conducted more than 1100 new competitive fitness assays. Consistent with the previous study, the power-law model fits the new data better than the hyperbolic model. We also analysed the variability in fitness among populations, finding subtle, but significant, heterogeneity in mean fitness. Some, but not all, of this variation reflects differences in mutation rate that evolved over time. Taken together, our results imply that both adaptation and divergence can continue indefinitely-or at least for a long time-even in a constant environment.

Evolutionary innovations allow populations to colonize new, previously inaccessible ecological niches. We previously reported that aerobic growth on citrate (Cit++) evolved in a population of Escherichia coli during adaptation to a minimal glucose medium containing citrate (DM25). Cit+ can grow in citrate-only medium (DM0), which is a novel environment for E. coli . To study adaptation to this new niche, we evolved one set of Cit+ populations for 2,500 generations in DM0 and a control set in DM25. We identified numerous parallel mutations, many mediated by transposable elements. Several lineages evolved multi-copy amplifications containing the maeA gene, constituting up to ~15% of the genome. We also found substantial cell death in ancestral and evolved clones. Our results demonstrate the importance of copy-number variation and transposable elements in the refinement of the Cit+ trait. However, the observed mortality suggests a persistent evolutionary mismatch between E. coli physiology and a citrate-only environment.

Evolution of a novel function can greatly alter the effects of an organism on its environment. These environmental changes can, in turn, affect the further evolution of that organism and any coexisting organisms. We examine these effects and feedbacks following evolution of a novel function in the long-term evolution experiment (LTEE) with Escherichia coli. A characteristic feature of E. coli is its inability to consume citrate aerobically. However, that ability evolved in one of the LTEE populations. In this population, citrate-utilizing bacteria (Cit+) coexisted stably with another clade of bacteria that lacked the capacity to utilize citrate (Cit−). This coexistence was shaped by the evolution of a cross-feeding relationship in which Cit+ cells released the dicarboxylic acids succinate, fumarate, and malate into the medium, and Cit− cells evolved improved growth on these carbon sources, as did the Cit+ cells. Thus, the evolution of citrate consumption led to a flask-based ecosystem that went from a single limiting resource, glucose, to one with five resources either shared or partitioned between two coexisting clades. Our findings show how evolutionary novelties can change environmental conditions, thereby facilitating diversity and altering both the structure of an ecosystem and the evolutionary trajectories of coexisting organisms.

Abstract A fitness landscape is a map between the genotype and its reproductive success in a given environment. The topography of fitness landscapes largely governs adaptive dynamics, constraining evolutionary trajectories and the predictability of evolution. Theory suggests that this topography can be “deformed” by mutations that produce substantial changes to the environment. In spite of its importance, the deformability of fitness landscapes has not been systematically studied beyond abstract models, and little is known about its reach and consequences in empirical systems. Here we have systematically characterized the deformability of the genome-wide metabolic fitness landscape of the bacterium E. coli . Deformability is quantified by the non-commutativity of epistatic interactions, which we experimentally demonstrate in mutant strains on the path to an evolutionary innovation. Our analysis shows that the deformation of fitness landscapes by metabolic mutations rarely affects evolutionary trajectories in the short-range. However, mutations with large environmental effects leave these as a “legacy”, producing long-range landscape deformations in distant regions of the genotype space that affect the fitness of later descendants. Our methods and results provide the basis for an integration between adaptive and eco-evolutionary dynamics with complex genetics and genomics.

In a long-term evolution experiment with Escherichia coli, bacteria in one of twelve populations evolved the ability to consume citrate, a previously unexploited resource in a glucose-limited medium. This innovation led to the frequency-dependent coexistence of citrate-consuming (Cit+) and non-consuming (Cit–) ecotypes, with Cit– bacteria persisting on the exogenously supplied glucose as well as other carbon molecules released by the Cit+ bacteria. After more than 10,000 generations of coexistence, however, the Cit– lineage went extinct; cells with the Cit– phenotype dropped to levels below detection, and the Cit– clade could not be detected by molecular assays based on its unique genotype. We hypothesized that this extinction event was a deterministic outcome of evolutionary change within the population, specifically the appearance of a more-fit Cit+ ecotype that competitively excluded the Cit– ecotype. We tested this hypothesis by re-evolving the population from one frozen sample taken just prior to the extinction and from another sample taken several thousand generations earlier, in each case for 500 generations and with 20-fold replication. To our surprise, the Cit– type did not go extinct in any of these replays, and Cit– cells also persisted in a single replicate that was propagated for 3,000 generations. Even more unexpectedly, we showed that the Cit– ecotype could reinvade the Cit+ population after its extinction. Taken together, these results indicate that the extinction of the Cit– ecotype was not a deterministic outcome driven by competitive exclusion by the Cit+ ecotype. The extinction also cannot be explained by demographic stochasticity, as the population size of the Cit– ecotype should have been many thousands of cells even during the daily transfer events. Instead, we infer that the extinction must have been caused by a rare chance event in which some aspect of the experimental conditions was inadvertently perturbed.