ABSTRACT Ancient DNA (aDNA) sequencing has enabled unprecedented reconstruction of speciation, migration, and admixture events for extinct taxa 1 . Outside the permafrost, however, irreversible aDNA post-mortem degradation 2 has so far limited aDNA recovery within the ˜0.5 million years (Ma) time range 3 . Tandem mass spectrometry (MS)-based collagen type I (COL1) sequencing provides direct access to older biomolecular information 4 , though with limited phylogenetic use. In the absence of molecular evidence, the speciation of several Early and Middle Pleistocene extinct species remain contentious. In this study, we address the phylogenetic relationships of the Eurasian Pleistocene Rhinocerotidae 5-7 using ˜1.77 million years (Ma) old dental enamel proteome sequences of a Stephanorhinus specimen from the Dmanisi archaeological site in Georgia (South Caucasus) 8 . Molecular phylogenetic analyses place the Dmanisi Stephanorhinus as a sister group to the woolly ( Coelodonta antiquitatis ) and Merck’s rhinoceros ( S. kirchbergensis ) clade. We show that Coelodonta evolved from an early Stephanorhinus lineage and that this genus includes at least two distinct evolutionary lines. As such, the genus Stephanorhinus is currently paraphyletic and its systematic revision is therefore needed. We demonstrate that Early Pleistocene dental enamel proteome sequencing overcomes the limits of ancient collagen- and aDNA-based phylogenetic inference, and also provides additional information about the sex and taxonomic assignment of the specimens analysed. Dental enamel, the hardest tissue in vertebrates, is highly abundant in the fossil record. Our findings reveal that palaeoproteomic investigation of this material can push biomolecular investigation further back into the Early Pleistocene.

Retracing complex population processes that precede extreme bottlenecks may be impossible using data from living individuals. The wisent (Bison bonasus), Europe's largest terrestrial mammal, exemplifies such a population history, having gone extinct in the wild but subsequently restored by captive breeding efforts. Using low coverage genomic data from modern and historical individuals, we investigate population processes occurring before and after this extinction. Analysis of aligned genomes supports the division of wisent into two previously recognised subspecies, but almost half of the genomic alignment contradicts this population history as a result of incomplete lineage sorting and admixture. Admixture between subspecies populations occurred prior to extinction and subsequently during the captive breeding program. Admixture with the Bos cattle lineage is also widespread but results from ancient events rather than recent hybridisation with domestics. Our study demonstrates the huge potential of historical genomes for both studying evolutionary histories and for guiding conservation strategies.

Palaeogenomics has greatly increased our knowledge of past evolutionary and ecological change, but has been restricted to the study of species that preserve as fossils. Here we show the potential of shotgun metagenomics to reveal population genomic information for a taxon that does not preserve in the body fossil record, the algae Nannochloropsis. We shotgun sequenced two lake sediment samples dated to the Last Glacial Maximum and identified N. limnetica as the dominant taxon. We then reconstructed full chloroplast and mitochondrial genomes to explore within-lake population genomic variation. This revealed at least two major haplogroups for each organellar genome, which could be assigned to known varieties of N. limnetica. The approach presented here demonstrates the utility of lake sedimentary ancient DNA (sedaDNA) for population genomic analysis, thereby opening the door to environmental palaeogenomics, which will unlock the full potential of sedaDNA.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

The extinct New World stilt-legged, or NWSL, equids constitute a perplexing group of Pleistocene horses endemic to North America. Their slender distal limb bones resemble those of Asiatic asses, such as the Persian onager. Previous palaeogenetic studies, however, have suggested a closer relationship to caballine horses than to Asiatic asses. Here, we report complete mitochondrial and partial nuclear genomes from NWSL equids from across their geographic range. Although multiple NWSL equid species have been named, our palaeogenomic and morphometric analyses support the idea that there was only a single species of middle to late Pleistocene NWSL equid, and demonstrate that it falls outside of crown group Equus. We therefore propose a new genus, Haringtonhippus, for the sole species H. francisci. Our combined genomic and phenomic approach to resolving the systematics of extinct megafauna will allow for an improved understanding of the full extent of the terminal Pleistocene extinction event.

The extinct passenger pigeon was once the most abundant bird in North America, and possibly the world. While theory predicts that large populations will be more genetically diverse and respond more efficiently to selection, passenger pigeon genetic diversity was surprisingly low. To investigate this we analysed 41 mitochondrial and 4 nuclear genomes from passenger pigeons, and 2 genomes from band-tailed pigeons, passenger pigeons' closest living relatives. We find that passenger pigeons' large population size allowed for faster adaptive evolution and removal of harmful mutations, but that this drove a huge loss in neutral genetic diversity. These results demonstrate how great an impact selection can have on a vertebrate genome, and invalidate previous results that suggested population instability contributed to this species' surprisingly rapid extinction.

Recent genomic analyses have provided substantial evidence for past periods of gene flow from polar bears (Ursus maritimus) into Alaskan brown bears (Ursus arctos), with some analyses suggesting a link between climate change and genomic introgression. However, because it has only been possible to sample bears from the present day, the timing, frequency, and evolutionary significance of this admixture remains unknown. Here, we analyze genomic DNA from three additional and geographically distinct brown bear populations, including two that lived temporally close to the peak of the last ice age. We find evidence of admixture in all three populations, suggesting that admixture between these species has been common in their recent evolutionary history. In addition, analyses of ten fossil bears from the now-extinct Irish population indicate that admixture peaked during the last ice age, when brown bear and polar bear ranges overlapped. Following this peak, the proportion of polar bear ancestry in Irish brown bears declined rapidly until their extinction. Our results support a model in which ice age climate change created geographically widespread conditions conducive to admixture between polar bears and brown bears, as is again occurring today. We postulate that this model will be informative for many admixing species pairs impacted by climate change. Our results highlight the power of paleogenomes to reveal patterns of evolutionary change that are otherwise masked with only contemporary data.