Abstract Idiopathic lung fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by chronic epithelial injury and exhausted repair capacity of the alveolar compartment, associated with the expansion of cells with intermediate alveolar epithelial cell (AT2) characteristics. Using Sftpc CreERT2/+ : tdTomato flox/flox mice, we previously identified a lung population of quiescent injury activated alveolar epithelial progenitors (IAAPs) marked by low expression of the AT2 lineage trace marker tdTomato (Tom low ), and characterized by high levels of Pd-l1 (Cd274) expression. This led us to hypothesize that a population with similar properties exists in the human lung. To that end, we used flow cytometry to characterize the CD274 cell surface expression in lung epithelial cells isolated from donor and end-stage IPF lungs. The identity and functional behavior of these cells were further characterized by qPCR analysis, in vitro organoid formation, and ex vivo precision-cut lung slices (PCLS). Our analysis led to the identification of a population of CD274 pos cells expressing intermediate levels of SFTPC , which was expanded in IPF lungs. While donor CD274 pos cells initiated clone formation, they did not expand significantly in 3D organoids in AT2-supportive conditions. However, an increased number of CD274 pos cells was found in cultured PCLS. In conclusion, we demonstrate that, similar to the IAAPs in the mouse lung, a population of CD274 expressing cells exists in the normal human lung and this population is expanded in the IPF lung and in an ex vivo PCLS assay, suggestive of progenitor cell behavior.

ABSTRACT Alveolar type 2 (AT2) cells are heterogeneous cells; where specialized AT2 subpopulations within this lineage exhibit stem cell properties. However, the existence of quiescent, immature cells within the AT2 lineage, which get activated during lung regeneration, is unknown. Sftpc CreERT2/+ ; tdTomato flox/flox mice were used for the labelling of AT2 cells and labeled subpopulations were analyzed by flow cytometry, qPCR, ATAC-seq, gene arrays, pneumonectomy, and culture of precision-cut lung slides. Human lungs from donor and IPF were also analyzed. In mice, we detected two distinct AT2 subpopulations with low tdTomato level (Tom Low ) and high tdTomato level (Tom High ). Tom Low express lower level of AT2 differentiation markers, Fgfr2b and Etv5 , while Tom High , as bona fide mature AT2 cells, show higher level of Sftpc , Sftpb , Sftpa1 , Fgfr2b , and Etv5 . ATAC-seq analysis indicates that Tom Low and Tom High constitute two distinct cell populations with specific silencing of Sftpc , Rosa26 and cell cycle gene loci in Tom Low . Upon pneumonectomy, Tom Low but not Tom High cells proliferate and upregulate the expression of Fgfr2b , Etv5 , Sftpc , Ccnd1 and Ccnd2 compared to sham. Tom Low cells overexpress PD-L1, an immune inhibitory membrane receptor ligand, which is used by flow cytometry to differentially isolate these two sub-populations. In the human lung, PD-L1 and HTII-280 antibodies are used by flow cytometry to differentially sort mature AT2 (HTII-280-high, PD-L1-low) as well as an additional subpopulation of epithelial cells characterized by HTII-280-Low and PD-L1-high. We have identified a novel population of AT2 quiescent immature progenitor cells in mouse that proliferate upon pneumonectomy and provided evidence for the existence of such cells in human. Significance of the work The characterization and mechanism of the proliferation of a novel and relevant pool of AT2 progenitor cells for the repair/regeneration process after injury are critical to improving respiratory function in patients with lung disease.

Alveolar epithelial cell type II (AEC2) injury underlies idiopathic pulmonary fibrosis (IPF). Here we show increased Notch1 signaling in AEC2s in human IPF and IPF models, causing enhanced proliferation and de-differentiation of AEC2s. As a result, we observed defective surfactant protein (SP)-B/C processing, elevated alveolar surface tension, repetitive alveolar collapse and development of lung fibrosis. Similar changes were encountered upon pharmacological inhibition of SP-B/C processing in vivo by pepstatin A. Inhibition of Notch signaling in cultured human IPF precision cut lung slices improved surfactant processing capacity of AEC2s and reversed fibrosis. Notch1 therefore offers as novel therapeutic target.One sentence summary Notch1 inhibition restores alveolar epithelial differentiation and surface tension and reverses matrix deposition in lung fibrosis

Idiopathic pulmonary fibrosis is a fatal, incurable lung disease in which the intricate alveolar network of the human lung is progressively replaced by fibrotic scars, eventually leading to respiratory failure. Myofibroblasts are the effector cells that lead to abnormal deposition of extracellular matrix proteins and therefore mediate fibrotic disease not only in the lung but also in other organs. Emerging literature suggests a correlation between fibrosis and metabolic alterations in IPF. In this study, we show that the first-line antidiabetic drug, metformin, exerts potent antifibrotic effects in the lung by modulating metabolic pathways, inhibiting TGFβ1 action, suppressing collagen formation, activating PPARγ signaling and inducing lipogenic differentiation in lung myofibroblasts derived from human patients. Using genetic lineage tracing in a murine model of lung fibrosis, we show that metformin alters the fate of myofibroblasts and accelerates fibrosis resolution by inducing myofibroblast-to-lipofibroblast transdifferentiation. Detailed pathway analysis showed that the reduction of collagen synthesis was largely AMPK-dependent, whereas the transdifferentiation of myo- to lipofibroblasts occurred in a BMP2-PPARγ-dependent fashion and was largely AMPK-independent. Our data report an unprecedented role for metformin in lung fibrosis, thus warranting further therapeutic evaluation.