Abstract Whether glyphosate-based herbicides (GBHs) are more potent than glyphosate alone at activating cellular mechanisms, which drive carcinogenesis remains controversial. As GBHs are more cytotoxic that glyphosate, we reasoned they may also be more capable of activating carcinogenic pathways. We tested this hypothesis by comparing the effects of glyphosate with Roundup GBHs both in vitro and in vivo . First, glyphosate was compared with representative GBHs namely MON 52276 (EU), MON 76473 (UK) and MON 76207 (USA) using the mammalian stem cell-based ToxTracker system. Here, MON 52276 and MON 76473, but not glyphosate and MON 76207, activated oxidative stress and unfolded protein responses. Second, molecular profiling of liver was performed in female Sprague-Dawley rats exposed to glyphosate or MON 52276 (both at 0.5, 50, 175 mg/kg bw/day glyphosate) for 90 days. MON 52276 but not glyphosate increased hepatic steatosis and necrosis. MON 52276 and glyphosate altered the expression of genes in liver reflecting TP53 activation by DNA damage and circadian rhythm regulation. Genes most affected in liver were similarly altered in kidneys. Small RNA profiling in liver showed decreased amounts of miR-22 and miR-17 from MON 52276 ingestion. Glyphosate decreased mir-30 while miR-10 levels were increased. DNA methylation profiling of liver revealed 5,727 and 4,496 differentially methylated CpG sites between the control and glyphosate and MON 52276 exposed animals respectively. Apurinic/apyrimidinic DNA damage formation in liver was increased with glyphosate exposure. Altogether, our results show that Roundup formulations cause more biological changes linked with carcinogenesis than glyphosate.

Abstract Human health effects from chronic exposure to mixtures of pesticide residues are little investigated. We compared standard histopathology and serum biochemistry measures and multi-omics analyses in an in vivo subchronic toxicity test of a mixture of six pesticide active ingredients frequently detected in foodstuffs (azoxystrobin, boscalid, chlorpyrifos, glyphosate, imidacloprid and thiabendazole). Sprague-Dawley rats were administered with the pesticide mixture with each ingredient at its regulatory permitted acceptable daily intake. Analysis of water and feed consumption, body weight, histopathology and serum biochemistry showed little or no physiological effects from exposure to the pesticide mixture. In marked contrast, analysis of the host-gut microbiome axis using serum and caecum metabolomics revealed that nicotinamide and tryptophan metabolism were affected, which suggested the initiation of a cell danger response, including adaptation to oxidative stress. Only limited effects were detected on the caecum microbiota by shotgun metagenomics. Further analyses of in vitro bacterial cultures showed that growth of Lactobacillus rhamnosus and Escherichia coli strains was negatively impacted by the pesticide mixture at concentrations that were not inhibitory when exposure was to a single agent. Transcriptomics of the liver showed that 257 genes had their expression changed. Gene functions affected included those involved in the regulation of response to hormones and correlated with previously reported transcriptome changes following administration of nicotinamide. Genome-wide DNA methylation analysis of the same liver samples showed that 4255 CpG sites were differentially methylated (> 10% difference). Overall, we demonstrated that unlike standard blood biochemical and organ histological analysis, in-depth molecular profiling using a combination of high-throughput ‘-omics’ methods in laboratory animals exposed to low concentrations of pesticides reveals metabolic effects on the gut-liver axis, which can potentially be used as biomarkers for the prediction of future negative health outcomes. Our data suggest that adoption of multi-omics as part of regulatory risk assessment procedures will result in more accurate outcome measures, with positive public health implications.

Abstract The potential health consequences of glyphosate-induced gut microbiome alterations have become a matter of intense debate. As part of a multifaceted study investigating toxicity, carcinogenicity and multigenerational effects of glyphosate and its commercial herbicide formulations, we assessed changes in bacterial and fungal populations in the caecum microbiota of rats exposed prenatally until adulthood (13 weeks after weaning) to three doses of glyphosate (0.5, 5, 50 mg/kg body weight/day), or to the formulated herbicide products Roundup Bioflow and RangerPro at the same glyphosate-equivalent doses. Caecum bacterial microbiota were evaluated by 16S rRNA sequencing whilst the fungal population was determined by ITS2 amplicon sequencing. Results showed that both fungal and bacterial diversity were affected by the Roundup formulations in a dose-dependent manner, whilst glyphosate alone significantly altered only bacterial diversity. At taxa level, a reduction in Bacteroidota abundance, marked by alterations in the levels of Alloprevotella, Prevotella and Prevotellaceae UCG-003 , was concomitant to increased levels of Firmicutes (e.g., Romboutsia, Dubosiella, Eubacterium brachy group or Christensenellaceae) and Actinobacteria (e.g., Enterorhabdus, Adlercreutzia , or Asaccharobacter ). Treponema and Mycoplasma also had their levels reduced by the pesticide treatments. Analysis of fungal composition indicated that the abundance of the rat gut commensal Ascomycota Kazachstania was reduced while the abundance of Gibberella, Penicillium, Claviceps, Cornuvesica, Candida, Trichoderma and Sarocladium were increased by exposure to the Roundup formulations, but not to glyphosate. Altogether, our data suggest that glyphosate and its Roundup RangerPro and Bioflow caused profound changes in caecum microbiome composition by affecting the fitness of major commensals, which in turn reduced competition and allowed opportunistic fungi to grow in the gut, in particular in animals exposed to the herbicide formulations. This further indicates that changes in gut microbiome composition might influence the long-term toxicity, carcinogenicity and multigenerational effects of glyphosate-based herbicides.

There is intense debate as to whether glyphosate can interfere with aromatic amino acid biosynthesis in microorganisms inhabiting the gastrointestinal tract, which could potentially lead to negative health outcomes. We have addressed this major gap in glyphosate toxicology by using a multi-omics strategy combining shotgun metagenomics and metabolomics. We tested whether glyphosate (0.5, 50, 175 mg/kg bw/day), or its representative EU commercial herbicide formulation MON 52276 at the same glyphosate equivalent doses, has an effect on the rat gut microbiome in a 90-day subchronic toxicity test. Clinical biochemistry measurements in blood and histopathological evaluations showed that MON 52276 but not glyphosate was associated with statistically significant increase in hepatic steatosis and necrosis. Similar lesions were also present in the liver of glyphosate-treated groups but not in the control group. Caecum metabolomics revealed that glyphosate inhibits the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate (EPSP) synthase in the shikimate pathway as evidenced by an accumulation of shikimic acid and 3-dehydroshikimic acid. Levels of caecal microbiome dipeptides involved in the regulation of redox balance (gamma-glutamylglutamine, cysteinylglycine, valylglycine) had their levels significantly increased. Shotgun metagenomics showed that glyphosate affected caecum microbial community structure and increased levels of Eggerthella spp. and Homeothermacea spp.. MON 52276, but not glyphosate, increased the relative abundance of Shinella zoogleoides. Since Shinella spp. are known to degrade alkaloids, its increased abundance may explain the decrease in solanidine levels measured with MON 52776 but not glyphosate. Other glyphosate formulations may have different effects since Roundup GT Plus inhibited bacterial growth in vitro at concentrations at which MON 52276 did not present any visible effect. Our study highlights the power of a multi-omics approach to investigate effects of pesticides on the gut microbiome. This revealed the first biomarker of glyphosate effects on rat gut microbiome. Although more studies will be needed to ascertain if there are health implications arising from glyphosate inhibition of the shikimate pathway in the gut microbiome, our findings can be used in environmental epidemiological studies to understand if glyphosate can have biological effects in human populations.

Background: Glyphosate-based herbicides (GBHs) are the world9s most widely used weed control agents. There has been intense and increasing public health concern about glyphosate and GBHs since the International Agency for Research on Cancer classified glyphosate as a probable human carcinogen in 2015. Aims: To further study the health effects of glyphosate and GBHs, the Ramazzini Institute, in collaboration with an international network of institutes and universities, has launched the Global Glyphosate Study (GGS), the most comprehensive toxicological study ever performed on these compounds. The GGS is an integrated study designed to test a wide range of toxicological outcomes including carcinogenicity, neurotoxicity, multi-generational effects, organ toxicity, endocrine disruption and prenatal developmental toxicity. The present study reports the first definitive results on leukemia incidence and mortality from the carcinogenicity arm of the GGS. Method: Glyphosate and two GBHs, Roundup Bioflow (MON 52276) used in the European Union (EU) and RangerPro (EPA 524-517) used in the U.S., were administered long-term to Sprague-Dawley (SD) rats beginning in prenatal life until 104 weeks of age via drinking water at doses of 0.5, 5, and 50 mg/kg body weight/day. This dose range encompasses both the EU Acceptable Daily Intake (ADI) and the EU No Observed Adverse Effect Level (NOAEL) for glyphosate. Each experimental group was composed of 51 males and 51 females, the total number animals were 1020 (510 males and 510 females). Results: In the animals exposed to glyphosate, a significantly increased trend in incidence of lymphoblastic leukemia was observed in males. In the Roundup Bioflow-treated animals, significantly increased trends were observed in incidence of lymphoblastic leukemia (males and females), monocytic leukemia (males), total myeloid leukemia (males), and all leukemias combined (males and females). In the RangerPro-treated animals, significantly increased trends were observed in incidence of lymphoblastic leukemia (males and females), monocytic leukemia (males) and all leukemias combined (males). 43% of leukemias deaths in the glyphosate and GBHs treated groups occurred before the first year of age (52 weeks). Conclusions: Glyphosate and GBHs at exposure levels corresponding to the EU ADI and the EU NOAEL caused significant, dose-related increased trends in incidence of leukemia, a very rare malignancy, in SD rats. Notably, about half of the leukemia deaths seen in the glyphosate and GBH groups occurred at less than one year of age, comparable to less than 35-40 years of age in humans.