Macromolecular transport between the nucleus and cytoplasm is mediated through Nuclear Pore Complexes (NPCs), which are built from multiple copies of roughly 34 distinct proteins, called nucleoporins 1–3 . Models of the NPC depict it as a composite of several sub-domains that have been named the outer rings, inner ring, cytoplasmic fibrils and nuclear basket. While the NPC has been extensively studied, the roles of individual nucleoporins within NPCs and their functional interactions remain poorly understood. Here, we applied a rapid degron system to systematically investigate how individual nucleoporins contribute toward NPC architecture. We find that acute depletion of outer ring components (NUP96 or NUP107) disperses the outer ring and cytoplasmic fibrils without disassembly of inner ring members. Conversely, rapid degradation of the inner ring complex component NUP188 disrupts the inner ring without dislodging outer ring members. We also found that depletion of NUP93 destabilized all NPC domains, indicating that it has a unique role as a lynchpin of NPC structure. Our data highlight the modular nature of NPC organization, suggesting that the outer and inner ring complexes do not extensively rely on each other for structural stability after NPC assembly is complete. This dynamic assessment provides new insights regarding the remarkable structural independence of domains within the NPC.

Abstract Bacteria of the genus Shigella cause shigellosis, a severe gastrointestinal disease driven by bacterial colonization of colonic intestinal epithelial cells. Vertebrates have evolved programmed cell death pathways that sense invasive enteric pathogens and eliminate their intracellular niche. Previously we reported that genetic removal of one such pathway, the NAIP–NLRC4 inflammasome, is sufficient to convert mice from resistant to susceptible to oral Shigella flexneri challenge (Mitchell, Roncaioli et al., 2020). Here, we investigate the protective role of additional cell death pathways during oral mouse Shigella infection. We find that the Caspase-11 inflammasome, which senses Shigella LPS, restricts Shigella colonization of the intestinal epithelium in the absence of NAIP–NLRC4. However, this protection is limited when Shigella expresses OspC3, an effector that antagonizes Caspase-11 activity. TNFα, a cytokine that activates Caspase-8-dependent apoptosis, also provides protection from Shigella colonization of the intestinal epithelium, but only in the absence of both NAIP– NLRC4 and Caspase-11. The combined genetic removal of Caspases-1,-11, and -8 renders mice hyper-susceptible to oral Shigella infection. Our findings uncover a layered hierarchy of cell death pathways that limit the ability of an invasive gastrointestinal pathogen to cause disease.

Abstract Bacteria of the genus Shigella cause shigellosis, a severe gastrointestinal disease that is a major cause of diarrhea-associated mortality in humans. Shigellosis develops upon oral ingestion of as few as 100 bacteria, but million-fold higher doses fail to cause disease in mice. The lack of a physiologically relevant mouse model of shigellosis has impeded our understanding of this important human disease, but why mice are resistant is unknown. Here we show that in human cells, but not in mice, Shigella evades detection by the NAIP–NLRC4 inflammasome, an immune sensor present in intestinal epithelial cells (IECs). We find that NAIP–NLRC4-deficient mice are highly susceptible to oral Shigella infection and recapitulate the clinical features of human shigellosis, including bacterial replication in IECs and neutrophilic inflammation of the colon. Confirming a role for bacterial replication in IECs in our new model, a Shigella mutant lacking IcsA, a factor required for cell-to-cell spread among IECs, is attenuated in otherwise susceptible NAIP–NLRC4-deficient mice. Although inflammasome-mediated cell death is widely held to promote Shigella infection and pathogenesis, we instead demonstrate that IEC-specific NAIP–NLRC4-induced cell death is sufficient to protect the host from shigellosis. Thus, NAIP–NLRC4-deficient mice are a physiologically relevant and experimentally tractable model for shigellosis. More broadly, our results suggest that the lack of an inflammasome response in IECs may help explain the extreme susceptibility of humans to shigellosis.

Summary Inflammasomes are cytosolic innate immune complexes that play a critical role in host defense against pathogens but can also contribute to inflammatory pathogenesis. Here, we find that the human inflammasome-forming sensor CARD8 senses HIV-1 infection via site-specific cleavage of the CARD8 N-terminus by the HIV protease (HIV-1 PR ). HIV-1 PR cleavage of CARD8 induces pyroptotic cell death and the release of pro-inflammatory cytokines from infected cells, processes that we find are dependent on Toll-like receptor stimulation prior to viral infection. Our evolutionary analyses reveal that the HIV-1 PR cleavage site in CARD8 is unique to humans, and that chimpanzee CARD8 does not recognize proteases from HIV or simian immunodeficiency viruses from chimpanzees (SIVcpz). In contrast, SIVcpz does cleave human CARD8, suggesting that SIVcpz was poised to activate the human CARD8 inflammasome prior to its cross-species transmission into humans and implicating the CARD8 inflammasome as a potential driver of HIV pathogenesis.

Abstract Hosts have evolved diverse strategies to respond to microbial infections, including the detection of pathogen-encoded proteases by inflammasome-forming sensors such as NLRP1 and CARD8. Here, we find that the 3CL protease (3CL pro ) encoded by diverse coronaviruses, including SARS-CoV-2, cleaves a rapidly evolving region of human CARD8 and activates a robust inflammasome response. CARD8 is required for cell death and the release of pro-inflammatory cytokines during SARS-CoV-2 infection. We further find that natural variation alters CARD8 sensing of 3CL pro , including 3CL pro -mediated antagonism rather than activation of megabat CARD8. Likewise, we find that a single nucleotide polymorphism (SNP) in humans reduces CARD8’s ability to sense coronavirus 3CL pros , and instead enables sensing of 3C proteases (3C pro ) from select picornaviruses. Our findings demonstrate that CARD8 is a broad sensor of viral protease activities and suggests that CARD8 diversity contributes to inter- and intra-species variation in inflammasome-mediated viral sensing and immunopathology.