Dynamin GTPase activity increases when it oligomerizes either into helices in the presence of lipid templates or into rings in the presence of SH3 domain proteins. Dynasore is a dynamin inhibitor of moderate potency ( IC 50 ˜ 15 μM in vitro ). We show that dynasore binds stoichiometrically to detergents used for in vitro drug screening, drastically reducing its potency ( IC 50 = 479 μM) and research tool utility. We synthesized a focused set of dihydroxyl and trihydroxyl dynasore analogs called the Dyngo™ compounds, five of which had improved potency, reduced detergent binding and reduced cytotoxicity, conferred by changes in the position and/or number of hydroxyl substituents. The Dyngo compound 4a was the most potent compound, exhibiting a 37‐fold improvement in potency over dynasore for liposome‐stimulated helical dynamin activity. In contrast, while dynasore about equally inhibited dynamin assembled in its helical or ring states, 4a and 6a exhibited >36‐fold reduced activity against rings, suggesting that they can discriminate between helical or ring oligomerization states. 4a and 6a inhibited dynamin‐dependent endocytosis of transferrin in multiple cell types ( IC 50 of 5.7 and 5.8 μM, respectively), at least sixfold more potently than dynasore, but had no effect on dynamin‐independent endocytosis of cholera toxin. 4a also reduced synaptic vesicle endocytosis and activity‐dependent bulk endocytosis in cultured neurons and synaptosomes. Overall, 4a and 6a are improved and versatile helical dynamin and endocytosis inhibitors in terms of potency, non‐specific binding and cytotoxicity. The data further suggest that the ring oligomerization state of dynamin is not required for clathrin‐mediated endocytosis .

Summary Dynamin mediates fission of vesicles from the plasma membrane during endocytosis. Typically, dynamin is recruited from the cytosol to endocytic sites, requiring seconds to tens of seconds. However, ultrafast endocytosis in neurons internalizes vesicles as quickly as 50 ms during synaptic vesicle recycling. Here we demonstrate that Dynamin 1 is pre-recruited to endocytic sites for ultrafast endocytosis. Specifically, Dynamin 1xA, a splice variant of Dynamin 1, interacts with Syndapin 1 to form molecular condensates on the plasma membrane when the proline-rich domain of this variant is dephosphorylated. When this domain is mutated to include phosphomimetic residues or Syndapin 1’s dynamin-interacting domain is mutated, Dynamin 1xA becomes diffuse, and consequently, ultrafast endocytosis slows down by ∼100-fold. Mechanistically, Syndapin 1 acts as an adaptor by binding the plasma membrane and stores Dynamin 1xA at endocytic sites. This cache bypasses the recruitment step and accelerates endocytosis at synapses.

Summary Cyclin-dependent kinase-like 5 (CDKL5) deficiency disorder (CDD) is a severe early-onset epileptic encephalopathy resulting mainly from de novo mutations in the X-linked CDKL5 gene. To determine whether loss of presynaptic CDKL5 function contributes to CDD, we examined synaptic vesicle (SV) recycling in primary hippocampal neurons generated from a Cdkl5 knockout rat model. Using a genetically-encoded reporter, we revealed that CDKL5 is selectively required for efficient SV endocytosis. We showed that CDKL5 kinase activity is both necessary and sufficient for optimal SV endocytosis, since kinase-inactive mutations failed to correct endocytosis in Cdkl5 knockout neurons, whereas the isolated CDKL5 kinase domain fully restored SV endocytosis kinetics. Finally, we demonstrated that CDKL5-mediated phosphorylation of amphiphysin 1, a putative presynaptic target, is not required for CDKL5-dependent control of SV endocytosis. Overall, our findings reveal a key presynaptic role for CDKL5 kinase activity and enhance our insight into how its dysfunction may culminate in CDD.

Summary Following exocytosis, the recapture of vesicular proteins stranded at the plasma membrane in recycling synaptic vesicles (SVs) is essential to sustain neurotransmission. Nanoclustering is emerging as a mechanism through which proteins may be ‘pre-assembled’ prior to endocytosis, to ensure high fidelity of retrieval for subsequent rounds of vesicle fusion. Here, we used single molecule imaging to examine the nanoclustering of synaptotagmin-1 (Syt1) and synaptic vesicle protein 2A (SV2A). Syt1 forms surface nanoclusters through interaction of its C2B domain (K326/K328) with SV2A, as demonstrated by mutating Syt1 (K326A/K328A) and knocking down endogenous SV2A. Blocking cognate interaction with Syt1 (SV2A T84A ) also decreased SV2A clustering. Impaired nanoclustering of Syt1 and SV2A leads to accelerated endocytosis of Syt1, altered intracellular sorting and decreased trafficking of Syt1 to a Rab5-positive endocytic pathway. We conclude that the interaction between SV2A and Syt1 locks both molecules into surface nanoclusters, controlling their entry into recycling SVs.

Abstract Pathogenic variants in SYNGAP1 are one of the most common genetic causes of nonsyndromic intellectual disability (ID) and are considered a risk for autism spectrum disorder (ASD). SYNGAP1 encodes a syn aptic G TPase a ctivating p rotein that modulates the intrinsic GTPase activity of several small G-proteins and is implicated in regulating the composition of the postsynaptic density. By targeting the deletion of exons encoding the calcium/lipid binding (C2) and G TPase a ctivating p rotein (GAP) domains, we generated a novel rat model to study SYNGAP related pathophysiology. We find that rats heterozygous for the C2/GAP domain deletion ( Syngap +/Δ-GAP ) exhibit reduced exploration and fear extinction, altered social behaviour, and spontaneous seizures, while homozygous mutants die within days after birth. This new rat model reveals that the enzymatic domains of SYNGAP are essential for normal brain function and provide an important new model system in the study of both ID/ASD and epilepsy.

ABSTRACT Synaptic vesicle (SV) recycling defects are linked to neurodevelopmental disorders, including fragile X syndrome (FXS), which results from loss of fragile X mental retardation protein (FMRP) encoded by the FMR1 gene. Hyperexcitability of neuronal circuits is a key feature of FXS, therefore we investigated whether SV recycling was affected by the absence of FMRP during increased neuronal activity. We revealed that primary neuronal cultures from a Fmr1 knockout rat model display a specific defect in activity-dependent bulk endocytosis (ADBE). This defect resulted in an inability of Fmr1 knockout neurons to sustain SV recycling during high frequency stimulation. Using a molecular replacement strategy, we also revealed that a human FMRP mutant that cannot bind BK channels failed to correct ADBE dysfunction in knockout neurons, however this dysfunction was corrected by BK channel agonists. Therefore, FMRP performs a key role in sustaining neurotransmitter release via selective control of ADBE, suggesting intervention via this endocytosis mode may correct hyperexcitabiltiy observed in FXS. SUMMARY Fragile X syndrome (FXS) is caused by loss of fragile X mental retardation protein (FMRP). Bonnycastle et al show that FMRP is specifically required for activity-dependent bulk endocytosis (ADBE), revealing 1) FMRP sustains neurotransmitter release and 2) intervention via ADBE may correct circuit hyperexcitabilty in FXS.

Abstract The multidomain adaptor protein amphiphysin-1 (Amph1) is an important coordinator of clathrin-mediated endocytosis in non-neuronal cells and synaptic vesicle (SV) endocytosis at central nerve terminals. Amph1 contains a lipid-binding N-BAR (Bin/Amphiphysin/Rvs) domain, central proline-rich (PRD) and clathrin/AP2 (CLAP) domains, and a C-terminal SH3 domain. All domains interact with either lipids or SV endocytosis proteins, with all of these interactions required for SV endocytosis, apart from the Amph1 PRD. In this study, we determined this role and confirmed requirements for established Amph1 interactions in SV endocytosis at typical small central synapses. Domain-specific interactions of Amph1 were validated using in vitro GST pull-down assays, with the role of these interactions in SV endocytosis determined in molecular replacement experiments in primary neuronal culture. Using this approach, we confirmed important roles for CLAP and SH3 domain interactions in the control of SV endocytosis. Furthermore, we identified an interaction site for the endocytosis protein endophilin A1 in the Amph1 PRD and revealed a key role for this interaction in SV endocytosis. Finally, we discovered that the phosphorylation status of Amph1-S293 within the PRD dictates the formation of the Amph1-endophilin A1 complex and is essential for efficient SV regeneration. This work therefore identifies an activity-dependent dephosphorylation-dependent interaction that is key for efficient SV endocytosis.

Abstract Background Mutations in the X-linked gene cyclin-dependent kinase-like 5 ( CDKL5 ) cause a severe neurological disorder characterised by early-onset epileptic seizures, autism and intellectual disability (ID). Impaired hippocampal function has been implicated in other models of monogenic forms of autism spectrum disorders and ID and is often linked to epilepsy and behavioural abnormalities. Many individuals with CDKL5 deficiency disorder (CDD) have null mutations and complete loss of CDKL5 protein, therefore in the current study we used a Cdkl5 −/y rat model to elucidate the impact of CDKL5 loss on cellular excitability and synaptic function of CA1 pyramidal cells (PCs). We hypothesised abnormal pre and/or post synaptic function and plasticity would be observed in the hippocampus of Cdkl5 −/y rats. Methods To allow cross-species comparisons of phenotypes associated with the loss of CDKL5, we generated a loss of function mutation in exon 8 of the rat Cdkl5 gene and assessed the impact of the loss of CDLK5 using a combination of extracellular and whole-cell electrophysiological recordings, biochemistry, and histology. Results Our results indicate that CA1 hippocampal long-term potentiation (LTP) is enhanced in slices prepared from juvenile, but not adult, Cdkl5 −/y rats. Enhanced LTP does not result from changes in NMDA receptor function or subunit expression as these remain unaltered throughout development. Furthermore, Ca 2+ permeable AMPA receptor mediated currents are unchanged in Cdkl5 −/y rats. We observe reduced mEPSC frequency accompanied by increased spine density in basal dendrites of CA1 PCs, however we find no evidence supporting an increase in silent synapses when assessed using a minimal stimulation protocol in slices. Additionally, we found no change in paired-pulse ratio, consistent with normal release probability at Schaffer collateral to CA1 PC synapses. Conclusions Our data indicate a role for CDKL5 in hippocampal synaptic function and raise the possibility that altered intracellular signalling rather than synaptic deficits contribute to the altered plasticity. Limitations This study has focussed on the electrophysiological and anatomical properties of hippocampal CA1 PCs across early postnatal development. Studies involving other brain regions, older animals and behavioural phenotypes associated with the loss of CDKL5 are needed to understand the pathophysiology of CDD.

Abstract Following exocytosis, the recapture of plasma membrane-stranded vesicular proteins into recycling synaptic vesicles (SVs) is essential for sustaining neurotransmission. Surface clustering of vesicular proteins has been postulated as a ‘pre-assembly’ mechanism for endocytosis – ensuring high-fidelity retrieval. Here, we used single-molecule imaging to examine the nanoclustering of synaptotagmin-1 (Syt1) and synaptic vesicle protein 2A (SV2A) in hippocampal neurons. Syt1 forms surface nanoclusters through interaction of its C2B domain with SV2A, that are sensitive to mutations in this domain (Syt1 K326A/K328A ) and knocking down SV2A. SV2A co-cluster with Syt1 and blocking SV2A’s cognate interaction with Syt1 (SV2A T84A ) also decreased SV2A clustering. Surprisingly, impairing SV2A-Syt1 nanoclustering enhanced plasma membrane recruitment of key endocytic protein dynamin-1, leading to accelerated Syt1 endocytosis, altered intracellular sorting and decreased trafficking of Syt1 to Rab5-positive endocytic compartments. SV2A-Syt1 surface nanoclusters therefore negatively regulate the rate of their own re-entry into recycling SVs by controlling the recruitment of the endocytic machinery.

Summary Endocytosis at synapses is accelerated by the pre-accumulation of Dynamin 1xA at the endocytic zone by Syndapin 1. However, it is unclear how these proteins support the ultrafast kinetics of endocytosis. Here we report that these proteins phase separate at the presynaptic endocytic zone where ultrafast endocytosis takes place. Specifically, the proline-rich motif of Dynamin 1xA interacts with the Src-Homology 3 domain of Syndapin 1 and forms liquid-like condensates. Single-particle tracking of Dynamin 1xA molecules at synapses shows that their diffusion slows down substantially when they are in the condensates, indicating the presence of molecular crowding and intermolecular interaction. When Dynamin 1xA is mutated to disrupt its interaction with Syndapin 1 the condensates do not form. Thus, the liquid-like assembly of these endocytic proteins provides a catalytic platform for ultrafast endocytosis.