Although genomewide RNA expression analysis has become a routine tool in biomedical research, extracting biological insight from such information remains a major challenge. Here, we describe a powerful analytical method called Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) for interpreting gene expression data. The method derives its power by focusing on gene sets, that is, groups of genes that share common biological function, chromosomal location, or regulation. We demonstrate how GSEA yields insights into several cancer-related data sets, including leukemia and lung cancer. Notably, where single-gene analysis finds little similarity between two independent studies of patient survival in lung cancer, GSEA reveals many biological pathways in common. The GSEA method is embodied in a freely available software package, together with an initial database of 1,325 biologically defined gene sets.

Somatic mutations have been extensively characterized in breast cancer, but the effects of these genetic alterations on the proteomic landscape remain poorly understood. Here we describe quantitative mass-spectrometry-based proteomic and phosphoproteomic analyses of 105 genomically annotated breast cancers, of which 77 provided high-quality data. Integrated analyses provided insights into the somatic cancer genome including the consequences of chromosomal loss, such as the 5q deletion characteristic of basal-like breast cancer. Interrogation of the 5q trans-effects against the Library of Integrated Network-based Cellular Signatures, connected loss of CETN3 and SKP1 to elevated expression of epidermal growth factor receptor (EGFR), and SKP1 loss also to increased SRC tyrosine kinase. Global proteomic data confirmed a stromal-enriched group of proteins in addition to basal and luminal clusters, and pathway analysis of the phosphoproteome identified a G-protein-coupled receptor cluster that was not readily identified at the mRNA level. In addition to ERBB2, other amplicon-associated highly phosphorylated kinases were identified, including CDK12, PAK1, PTK2, RIPK2 and TLK2. We demonstrate that proteogenomic analysis of breast cancer elucidates the functional consequences of somatic mutations, narrows candidate nominations for driver genes within large deletions and amplified regions, and identifies therapeutic targets. Quantitative mass-spectrometry-based proteomic and phosphoproteomic analyses of genomically annotated human breast cancer samples elucidates functional consequences of somatic mutations, narrows candidate nominations for driver genes within large deletions and amplified regions, and identifies potential therapeutic targets. This large-scale collaborative study describes quantitative-mass spectrometry-based proteomic and phosphoproteomic analyses of 105 breast cancer samples from The Cancer Genome Atlas (TCGA), representing the four principal mRNA-defined breast cancer intrinsic subtypes. The result is a high-quality proteomic resource for human breast cancer investigation, achieved using technologies and analytical approaches that illuminate the connections between genome and proteome. The data narrow candidate nominations for driver genes within large deletions and amplified regions, and identify potential therapeutic targets.

Extensive genomic characterization of human cancers presents the problem of inference from genomic abnormalities to cancer phenotypes. To address this problem, we analysed proteomes of colon and rectal tumours characterized previously by The Cancer Genome Atlas (TCGA) and perform integrated proteogenomic analyses. Somatic variants displayed reduced protein abundance compared to germline variants. Messenger RNA transcript abundance did not reliably predict protein abundance differences between tumours. Proteomics identified five proteomic subtypes in the TCGA cohort, two of which overlapped with the TCGA 'microsatellite instability/CpG island methylation phenotype' transcriptomic subtype, but had distinct mutation, methylation and protein expression patterns associated with different clinical outcomes. Although copy number alterations showed strong cis- and trans-effects on mRNA abundance, relatively few of these extend to the protein level. Thus, proteomics data enabled prioritization of candidate driver genes. The chromosome 20q amplicon was associated with the largest global changes at both mRNA and protein levels; proteomics data highlighted potential 20q candidates, including HNF4A (hepatocyte nuclear factor 4, alpha), TOMM34 (translocase of outer mitochondrial membrane 34) and SRC (SRC proto-oncogene, non-receptor tyrosine kinase). Integrated proteogenomic analysis provides functional context to interpret genomic abnormalities and affords a new paradigm for understanding cancer biology.

Although multiple reaction monitoring (MRM) mass spectrometry holds considerable promise for quantifying candidate protein biomarkers in blood, transferability of MRM assays between laboratories has never been shown. Addona et al. assess the reproducibility, dynamic range and limits of detection and quantification of MRM across multiple sites. Verification of candidate biomarkers relies upon specific, quantitative assays optimized for selective detection of target proteins, and is increasingly viewed as a critical step in the discovery pipeline that bridges unbiased biomarker discovery to preclinical validation. Although individual laboratories have demonstrated that multiple reaction monitoring (MRM) coupled with isotope dilution mass spectrometry can quantify candidate protein biomarkers in plasma, reproducibility and transferability of these assays between laboratories have not been demonstrated. We describe a multilaboratory study to assess reproducibility, recovery, linear dynamic range and limits of detection and quantification of multiplexed, MRM-based assays, conducted by NCI-CPTAC. Using common materials and standardized protocols, we demonstrate that these assays can be highly reproducible within and across laboratories and instrument platforms, and are sensitive to low μg/ml protein concentrations in unfractionated plasma. We provide data and benchmarks against which individual laboratories can compare their performance and evaluate new technologies for biomarker verification in plasma.

Summary

 To provide a detailed analysis of the molecular components and underlying mechanisms associated with ovarian cancer, we performed a comprehensive mass-spectrometry-based proteomic characterization of 174 ovarian tumors previously analyzed by The Cancer Genome Atlas (TCGA), of which 169 were high-grade serous carcinomas (HGSCs). Integrating our proteomic measurements with the genomic data yielded a number of insights into disease, such as how different copy-number alternations influence the proteome, the proteins associated with chromosomal instability, the sets of signaling pathways that diverse genome rearrangements converge on, and the ones most associated with short overall survival. Specific protein acetylations associated with homologous recombination deficiency suggest a potential means for stratifying patients for therapy. In addition to providing a valuable resource, these findings provide a view of how the somatic genome drives the cancer proteome and associations between protein and post-translational modification levels and clinical outcomes in HGSC. 

Video Abstract

We demonstrate that in S. cerevisiae the rate of ongoing S phase is slowed when the DNA is subjected to alkylation. Slowing of replication is dependent on the MEC1 and RAD53 genes, indicating that lesions alone do not slow replication in vivo and that the slowing is an active process. While it has been shown that a MEC1- and RAD53-dependent checkpoint responds to blocked replication or DNA damage by inhibiting the onset of mitosis, we demonstrate that this checkpoint must also have an additional target within S phase that controls replication rate. MEC1 is a homolog of the human ATM gene, which is mutated in ataxia telangiectasia (AT) patients. Like mec1 yeast, AT cells are characterized by damage-resistant DNA synthesis, highlighting the congruence of the yeast and mammalian systems.

Summary

 We performed the first proteogenomic study on a prospectively collected colon cancer cohort. Comparative proteomic and phosphoproteomic analysis of paired tumor and normal adjacent tissues produced a catalog of colon cancer-associated proteins and phosphosites, including known and putative new biomarkers, drug targets, and cancer/testis antigens. Proteogenomic integration not only prioritized genomically inferred targets, such as copy-number drivers and mutation-derived neoantigens, but also yielded novel findings. Phosphoproteomics data associated Rb phosphorylation with increased proliferation and decreased apoptosis in colon cancer, which explains why this classical tumor suppressor is amplified in colon tumors and suggests a rationale for targeting Rb phosphorylation in colon cancer. Proteomics identified an association between decreased CD8 T cell infiltration and increased glycolysis in microsatellite instability-high (MSI-H) tumors, suggesting glycolysis as a potential target to overcome the resistance of MSI-H tumors to immune checkpoint blockade. Proteogenomics presents new avenues for biological discoveries and therapeutic development.

The complexity of proteomic instrumentation for LC-MS/MS introduces many possible sources of variability. Data-dependent sampling of peptides constitutes a stochastic element at the heart of discovery proteomics. Although this variation impacts the identification of peptides, proteomic identifications are far from completely random. In this study, we analyzed interlaboratory data sets from the NCI Clinical Proteomic Technology Assessment for Cancer to examine repeatability and reproducibility in peptide and protein identifications. Included data spanned 144 LC-MS/MS experiments on four Thermo LTQ and four Orbitrap instruments. Samples included yeast lysate, the NCI-20 defined dynamic range protein mix, and the Sigma UPS 1 defined equimolar protein mix. Some of our findings reinforced conventional wisdom, such as repeatability and reproducibility being higher for proteins than for peptides. Most lessons from the data, however, were more subtle. Orbitraps proved capable of higher repeatability and reproducibility, but aberrant performance occasionally erased these gains. Even the simplest protein digestions yielded more peptide ions than LC-MS/MS could identify during a single experiment. We observed that peptide lists from pairs of technical replicates overlapped by 35−60%, giving a range for peptide-level repeatability in these experiments. Sample complexity did not appear to affect peptide identification repeatability, even as numbers of identified spectra changed by an order of magnitude. Statistical analysis of protein spectral counts revealed greater stability across technical replicates for Orbitraps, making them superior to LTQ instruments for biomarker candidate discovery. The most repeatable peptides were those corresponding to conventional tryptic cleavage sites, those that produced intense MS signals, and those that resulted from proteins generating many distinct peptides. Reproducibility among different instruments of the same type lagged behind repeatability of technical replicates on a single instrument by several percent. These findings reinforce the importance of evaluating repeatability as a fundamental characteristic of analytical technologies.

Summary

 To elucidate the deregulated functional modules that drive clear cell renal cell carcinoma (ccRCC), we performed comprehensive genomic, epigenomic, transcriptomic, proteomic, and phosphoproteomic characterization of treatment-naive ccRCC and paired normal adjacent tissue samples. Genomic analyses identified a distinct molecular subgroup associated with genomic instability. Integration of proteogenomic measurements uniquely identified protein dysregulation of cellular mechanisms impacted by genomic alterations, including oxidative phosphorylation-related metabolism, protein translation processes, and phospho-signaling modules. To assess the degree of immune infiltration in individual tumors, we identified microenvironment cell signatures that delineated four immune-based ccRCC subtypes characterized by distinct cellular pathways. This study reports a large-scale proteogenomic analysis of ccRCC to discern the functional impact of genomic alterations and provides evidence for rational treatment selection stemming from ccRCC pathobiology.

Adoption of targeted mass spectrometry (MS) approaches such as multiple reaction monitoring (MRM) to study biological and biomedical questions is well underway in the proteomics community. Successful application depends on the ability to generate reliable assays that uniquely and confidently identify target peptides in a sample. Unfortunately, there is a wide range of criteria being applied to say that an assay has been successfully developed. There is no consensus on what criteria are acceptable and little understanding of the impact of variable criteria on the quality of the results generated. Publications describing targeted MS assays for peptides frequently do not contain sufficient information for readers to establish confidence that the tests work as intended or to be able to apply the tests described in their own labs. Guidance must be developed so that targeted MS assays with established performance can be made widely distributed and applied by many labs worldwide. To begin to address the problems and their solutions, a workshop was held at the National Institutes of Health with representatives from the multiple communities developing and employing targeted MS assays. Participants discussed the analytical goals of their experiments and the experimental evidence needed to establish that the assays they develop work as intended and are achieving the required levels of performance. Using this “fit-for-purpose” approach, the group defined three tiers of assays distinguished by their performance and extent of analytical characterization. Computational and statistical tools useful for the analysis of targeted MS results were described. Participants also detailed the information that authors need to provide in their manuscripts to enable reviewers and readers to clearly understand what procedures were performed and to evaluate the reliability of the peptide or protein quantification measurements reported. This paper presents a summary of the meeting and recommendations. Adoption of targeted mass spectrometry (MS) approaches such as multiple reaction monitoring (MRM) to study biological and biomedical questions is well underway in the proteomics community. Successful application depends on the ability to generate reliable assays that uniquely and confidently identify target peptides in a sample. Unfortunately, there is a wide range of criteria being applied to say that an assay has been successfully developed. There is no consensus on what criteria are acceptable and little understanding of the impact of variable criteria on the quality of the results generated. Publications describing targeted MS assays for peptides frequently do not contain sufficient information for readers to establish confidence that the tests work as intended or to be able to apply the tests described in their own labs. Guidance must be developed so that targeted MS assays with established performance can be made widely distributed and applied by many labs worldwide. To begin to address the problems and their solutions, a workshop was held at the National Institutes of Health with representatives from the multiple communities developing and employing targeted MS assays. Participants discussed the analytical goals of their experiments and the experimental evidence needed to establish that the assays they develop work as intended and are achieving the required levels of performance. Using this “fit-for-purpose” approach, the group defined three tiers of assays distinguished by their performance and extent of analytical characterization. Computational and statistical tools useful for the analysis of targeted MS results were described. Participants also detailed the information that authors need to provide in their manuscripts to enable reviewers and readers to clearly understand what procedures were performed and to evaluate the reliability of the peptide or protein quantification measurements reported. This paper presents a summary of the meeting and recommendations. Targeted mass spectrometry (MS) approaches have tremendous promise for specific, reproducible and quantitative measurement of changes in the levels of proteins, peptides, and modified peptides of interest to biologists and biomedical researchers (1Gillette M.A. Carr S.A. Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry.Nat Methods. 2013; 10: 28-34Crossref PubMed Scopus (359) Google Scholar, 2Picotti P. Aebersold R. Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions.Nat. Methods. 2012; 9: 555-566Crossref PubMed Scopus (991) Google Scholar, 3Grebe S.K.G. Singh R.J.J. LC-MS/MS in the clinical laboratory—where to from here? Clin.Biochem. Rev. 2011; 32: 5-31Google Scholar and references therein). Adoption of targeted MS to study biological and clinical questions is well underway in the biomedical community with the assumption being that the measurements made using targeted MS methods are reliable, that is that they specifically identify and quantify the analytes targeted in a sample. In the field of proteomics, umbrella terms like “multiple reaction monitoring”, “selected reaction monitoring” (MRM 1The abbreviations used are:MRMmultiple reaction monitoringSRMselected reaction monitoringLODlimits of detectionLOQlimits of quantificationLLOQlower limits of quantification. 1The abbreviations used are:MRMmultiple reaction monitoringSRMselected reaction monitoringLODlimits of detectionLOQlimits of quantificationLLOQlower limits of quantification. and SRM, respectively; terms used interchangeably), “absolute quantification” and “targeted MS” can convey the erroneous message that the results are unquestionably correct with respect to what is being detected and how much is present. This is certainly not true, and is dependent on the extent to which the measurements have been analytically validated. multiple reaction monitoring selected reaction monitoring limits of detection limits of quantification lower limits of quantification. multiple reaction monitoring selected reaction monitoring limits of detection limits of quantification lower limits of quantification. The most widely used targeted MS approach at present is MRM (1Gillette M.A. Carr S.A. Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry.Nat Methods. 2013; 10: 28-34Crossref PubMed Scopus (359) Google Scholar, 2Picotti P. Aebersold R. Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions.Nat. Methods. 2012; 9: 555-566Crossref PubMed Scopus (991) Google Scholar, 3Grebe S.K.G. Singh R.J.J. LC-MS/MS in the clinical laboratory—where to from here? Clin.Biochem. Rev. 2011; 32: 5-31Google Scholar). Unlike discovery proteomics experiments in which full-scan MS/MS spectra are collected, in MRM only three to five fragment ions per-precursor are monitored, typically on triple quadrupole MS systems, the most widely available MS instruments in clinical and drug metabolism laboratories. The fragment ions monitored are generally those that are most abundant rather than those that are most sequence informative; as a result there is little-to-no sequence information in MRM data. Furthermore, in complex matrices like plasma, tissue or cell lysates, peptides with the same or similar precursor mass-to-charge ratio (e.g. ±1.5 in m/z) to an analyte of interest can give rise to many and sometimes all of the three to five fragment ions monitored for a specific analyte, resulting in false positives. Therefore, it is essential that other information be used to increase confidence in assignment and quantification in targeted MS experiments. In contrast to the long and well developed history of MS-based assay development for small molecules, drugs and metabolites (3Grebe S.K.G. Singh R.J.J. LC-MS/MS in the clinical laboratory—where to from here? Clin.Biochem. Rev. 2011; 32: 5-31Google Scholar, 4Lawson A.M. The scope of mass spectrometry in clinical chemistry.Clin. Chem. 1975; 21: 803-824Crossref PubMed Scopus (48) Google Scholar, 5Parsons H.G. Stable isotopes in the management and diagnosis of inborn errors of metabolism.Can. J. Physiol. Pharmacol. 1990; 68: 950-954Crossref PubMed Scopus (3) Google Scholar, 6Brumley W.C. Sphon J.A. Regulatory mass spectrometry.Biomed. Mass Spectrom. 1981; 8: 390-396Crossref PubMed Scopus (13) Google Scholar, 7Sphon J.A. Use of mass spectrometry for confirmation of animal drug residues.J. Assoc. Off. Anal. Chem. 1978; 61: 1247-1252PubMed Google Scholar, 8Vargo J.D. Determination of sulfonic acid degradates of chloroacetanilide and chloroacetamide herbicides in groundwater by LC/MS/MS.Anal. Chem. 1998; 70: 2699-2703Crossref PubMed Scopus (45) Google Scholar, 9Kuhara T. Noninvasive human metabolome analysis for differential diagnosis of inborn errors of metabolism.J. Chromatog. 2007; 855: 42-50Google Scholar, 10Pitt J.J. Eggington M. Kahler S.G. Comprehensive screening of urine samples from inborn errors of metabolism by electrospray tandem mass spectrometry.Clin. Chem. 2002; 48: 1970-1980Crossref PubMed Scopus (96) Google Scholar), consensus on what performance criteria are essential to define for peptide and protein assay development has yet to be achieved. This has led to a range of problems that continue to plague the development of reliable proteomic assays for both clinical and biological studies. For example, currently, a wide range of criteria are being applied in the proteomics community to assert that an assay has been successfully developed and that analytes of interest are being confidently detected and changes in their levels reliably quantified. Proteomics scientists are only slowly implementing practices in targeted, quantitative assay development that have been learned and adopted by the small molecule community (11Timmerman P. Anders Kall M. Gordon B. Laakso S. Freisleben A. Hucker R. Best practices in a tiered approach to metabolite quantification: Views and recommendations of the European Bioanalysis Forum.Bioanalysis. 2010; 2: 1185-1194Crossref PubMed Scopus (65) Google Scholar, 12Timmerman P. Herling C. Stoellner D. Jaitner B. Pihl S. Elsby K. Henderson N. Barroso B. Fischmann S. Companjen A. Versteilen A. Bates S. Kingsley C. Kunz U. European Bioanalysis Forum recommendation on method establishment and bioanalysis of biomarkers in support of drug development.Bioanalysis. 2012; 4: 1883-1894Crossref PubMed Scopus (45) Google Scholar, 13Timmerman P. Lausecker B. Barosso B. van Amsterdam P. Luedtke S. Dijksman J. ‘Large Meets Small’: connecting the bioanalytical community around peptide and protein bioanalysis with LC-MS(/MS).Bioanalysis. 2012; 4: 627-631Crossref PubMed Scopus (12) Google Scholar). Equally troubling is that targeted-MS papers are being published without clear and complete documentation of the analytical methods used or the assay performance, making it difficult if not impossible for reviewers and readers to have confidence that the tests work as intended to apply the tests described in their own labs with an expectation that similar results can be achieved. Therefore, we assert that strong, consensus guidance must be developed addressing quality assay development, if targeted proteomics is going to have the impact we all desire it to have, providing accurate, reliable assays of known performance metrics that can be widely distributed and applied by many labs worldwide. To begin to address the problems and their solutions, a workshop was held June 18 and 19, 2013 at the National Institutes of Health under the auspices of the National Cancer Institute (CPTAC - Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium) and National Heart, Lung, and Blood Institute (Proteomics Centers). Representatives from the multiple communities developing and employing targeted assays were present, including in vitro diagnostic companies, clinical laboratories, labs specializing in quantitative assay development for candidate biomarker verification and biology-focused labs. Investigators with long experience in the application of targeted MS methods for quantification of small molecules were invited to provide a review of the decades of practice and application of MRM in small molecule quantification, providing a foundation to principles that are equally applicable to the proteomic applications under discussion. Speakers and participants were asked to use a “fit-for-purpose” approach by identifying the analytical goals of their experiments and then to describe the performance characteristics required for success (14Thompson M. Ramsey M.H. Quality concepts and practices applies to sampling – an exploratory study.Analyst. 1995; 120: 261-270Crossref Scopus (89) Google Scholar, 15Bethem R. Boyd R.K. Mass spectrometry in trace analysis.J. Amer. Soc. Mass Spectrom. 1998; 9: 643-648Crossref Scopus (28) Google Scholar, 16Bethem R. Boison J. Gale J. Heller D. Lehotay S. Loo J. Musser S. Price P. Stein S. Establishing the fitness for purpose of mass spectrometric methods.J. Amer. Soc. Mass Spectrom. 2003; 14: 528-541Crossref PubMed Scopus (77) Google Scholar, 17Lee J.W. Devanarayan V. Barrett Y.C. Weiner R. Allinson J. Fountain S. Keller S. Weinryb I. Green M. Duan L. Rogers J.A. Millham R. O'Brien P.J. Sailstad J. Khan M. Ray C. Wagner J.A. Fit-for-purpose method development and validation for successful biomarker measurement.Pharm. Res. 2006; 23: 312-328Crossref PubMed Scopus (612) Google Scholar, 18Lee J.W. Figeys D. Vasilescu J. Biomarker assay translation from discovery to clinical studies in cancer drug development: quantification of emerging protein biomarkers.Adv. Cancer Res. 2007; 96: 269-298Crossref PubMed Scopus (69) Google Scholar, 19Cummings J. Raynaud F. Jones L. Sugar R. Dive C. on behalf of the Bioanalysis and Quality Assurance (BAQA) Group of the ECMCFit-for-purpose biomarker method validation for application in clinical trials of anticancer drugs.Br. J. Cancer. 2010; 103: 1313-1317Crossref PubMed Scopus (85) Google Scholar). Based on the goals of the measurements, we next sought to identify the experimental evidence (i.e. the “analytical validation” steps) needed to establish that the assays reported are working as intended and are achieving the required levels of performance (including the test's repeatability, reproducibility, limits of detection, analytical specificity, etc.). Computational and statistical tools useful for the analysis of targeted MS results, including generation of response/calibration curves, determination of limits of detection and quantification (LOD and LOQ, respectively), were discussed. This process led to the identification of three “Tiers” of assays/measurements that are described in detail, below. Participants were also asked to identify what information authors need to provide in their manuscripts to enable reviewers and readers to clearly understand what procedures were performed and to evaluate the reliability of the peptide or protein quantification measurements reported. We present a summary of those recommendations, below. As follow-on to the workshop and this report, Molecular and Cellular Proteomics intends to develop guidelines for authors of papers describing development and/or application of targeted MS methods. The need for establishing guidelines for authors parallels the situation in discovery proteomics before 2004 when similar issues relating to lack of ability to ascertain reliability of published results prompted the journal Molecular and Cellular Proteomics to develop and adopt the first set of guidelines for publication of peptide and protein identification data using mass spectrometry (20Carr S.A. Aebersold R. Baldwin M. Burlingame A. Clauser K. Nesvizhski A. The need for guidelines in publication of peptide and protein identification data.Mol. Cell. Proteomics. 2004; 3: 531-533Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (412) Google Scholar). These guidelines, which have been repeatedly revised and updated over the past several years (21Bradshaw R.A. Burlingame A.L. Carr S. Aebersold R. Reporting protein identification data: the next generation of guidelines.Mol. Cell. Proteomics. 2006; 5: 787-788Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (203) Google Scholar, 22Chalkley R.J. Clauser K.R. Carr S.A. Updating the MCP Proteomic publication guidelines.ASBMB Today. 2009; : 16-17Google Scholar, 23http://www.mcponline.org.libproxy.mit.edu/site/misc/PhialdelphiaGuidelinesFINALDRAFT.pdfGoogle Scholar), have been embraced in whole or in part by other proteomics journals. The goal then, as it is now, was to try to ensure that reliable, high quality data and results are entering the proteomics literature. The group identified three tiers of targeted MS assays/measurements based on the intended purpose of the measurements (“fit for purpose” concept) and then worked to define the extent of analytical validation required in each Tier (Table I). A list of speakers, presentations, and discussion groups is available in supplemental Materials.Table IThree Tiers of Targeted MS Measurements; experimental design parameters and assay characteristics are listed for each tier Andy Hoofnagle, University of Washington and Russell Grant, Laboratory Corporation of America led the discussion around Tier 1. The goals of developing and applying Tier 1 assays are to (1) provide accurate, precise, clinically actionable information for medical practitioners or (2) inform decision-making in the development of drugs for human use. In pharmaceutical applications the goals include quantifying proteins targeted by therapeutics, assessment of target engagement (free, complex, total) in preclinical and proof of concept studies, and measurement of mechanistic, protein biomarkers that are proximal to the target/site of action to examine pharmacodynamics. Depending on the use of the assay data, these tests may need to meet the requirements of the Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988 (CLIA), the US Food and Drug Administration (FDA), or the European Medicines Agency (EMA) (for example, see 24Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. (2001) US Department of Health and Human Services, US FDA, Center for Drug Evaluation and Research, Rockville, MD, U.S.A. (Rev. 1, September, 2013)Google Scholar, 25Guideline on Bioanalytical Method Validation. EMA, Committee for Medicinal Products for Human Use, London, UK2011Google Scholar). Guidance from these agencies and accrediting organizations, as well as those from the Clinical and Laboratory Standards Institute (http://www.clsi.org) continues to evolve and be clarified, especially for newer approaches in protein analysis, like targeted MS. These changes and clarifications are driven, in part, through dialog and interaction among the pharmaceutical, diagnostic companies, and regulatory agencies all working to improve assay quality when it pertains, even indirectly, to the care of patients (for example, see 26DeSilvaWhite paper on recent issues in bioanalysis and alignment of multiple guidelines.Bioanalysis. 2012; 4: 2213-2226Crossref PubMed Scopus (83) Google Scholar). The goal is to provide complete, high-quality data for review for regulatory purposes. The use of stable isotope-labeled internal standards provides the highest level of detection confidence and measurement precision in targeted MS experiments (26DeSilvaWhite paper on recent issues in bioanalysis and alignment of multiple guidelines.Bioanalysis. 2012; 4: 2213-2226Crossref PubMed Scopus (83) Google Scholar, 27Barr J.R. Maggio V.L. Patterson Jr., D.G. Cooper G.R. Henderson L.O. Turner W.E. et al.Isotope dilution–mass spectrometric quantification of specific proteins: model application with apolipoprotein A-I.Clin Chem. 1996; 42: 1676-1682Crossref PubMed Scopus (321) Google Scholar, 28Gerber S.A. Rush J. Stemman O. Kirschner M.W. Gygi S.P. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS.Proc. Nat. Acad. Sci. 2003; 100: 6940-6945Crossref PubMed Scopus (1542) Google Scholar, 29Keshishian H. Addona T. Burgess M. Kuhn E. Carr S.A. Quantitative, multiplexed assays for low abundance proteins in plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.Mol. Cell. Proteomics. 2007; 2: 2212Abstract Full Text Full Text PDF Scopus (576) Google Scholar, 30Berna M.J. Ott L. Engle S. Watson D. Solter P. Ackermann B. Quantification of NTproBNP in rat serum using immunoprecipitation and LC/MS/MS: a Biomarker of drug-induced cardiac hypertrophy.Anal. Chem. 2008; 80: 561-566Crossref PubMed Scopus (58) Google Scholar, 31Addona T.A. Abbatiello S.E. Schilling B. Skates S.J. Mani D.R. Bunk D.M. Spiegelman C.H. Zimmerman L.J. Ham A.J.L. Keshishian H. Hall S.C. Allen S. Blackman R.K. Borchers C.H. Buck C. Cardasis H.L. Cusack M.P. Dodder N.G. Gibson B.W. Held J.M. Hiltke T. Jackson A. Johansen E.B. Kinsinger C.R. Li J. Mesri M. Neubert T.A. Niles R.K. Pulsipher T.C. Ransohoff D. Rodriguez H. Rudnick P.A. Smith D. Tabb D.L. Tegeler T.J. Variyath A.M. Vega-Montoto L.J. Wahlander A. Waldemarson S. Wang M. Whiteaker J.R. Zhao L. Anderson N.L. Fisher S.J. Liebler D.C. Paulovich A.G. Regnier F.E. Tempst P. Carr S.A. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma.Nat. Biotechnol. 2009; 27: 633-685Crossref PubMed Scopus (862) Google Scholar, 32Picotti P. Bodenmiller B. Mueller L.N. Domon B. Aebersold R. Full dynamic range proteome analysis of S. cerevisiae by targeted proteomics.Cell. 2009; 138 (doi: 10.1016/j.cell.2009.05.051. Epub 2009 Aug 6): 795-806Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (647) Google Scholar, 33Whiteaker J.R. Zhao L. Abbatiello S.E. Burgess M. Kuhn E. Lin C.W. Pope M.E. Razavi M. Anderson N.L. Pearson T.W. Carr S.A. Paulovich A.G. Evaluation of large scale quantitative proteomic assay development using peptide affinity-based mass spectrometry.Mol. Cell. Proteomics. 2011; 10 (M110.005645)Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (119) Google Scholar, 34Shi T. Fillmore T.L. Sun X. Zhao R. Schepmoes A.A. Hossain M. Xie F. Wu S. Kim J.S. Jones N. Moore R.J. Pasa-Tolic L. Kagan J. Rodland K.D. Liu T. Tang K. Camp D.G. Smith R.D. Qian W.J. Antibody-free, targeted mass-spectrometric approach for quantification of proteins at low picogram per milliliter levels in human plasma/serum.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2012; 109: 15395-15400Crossref PubMed Scopus (171) Google Scholar, 35Wang Q. Chaerkady R. Wu J. Hwang H.J. Papadopoulos N. Kopelovich L. Maitra. A. Matthaei H. Eshleman J.R. Hruban R.H. Kinzler K.W. Pandey A. Vogelstein B. Mutant proteins as cancer-specific biomarkers.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2011; 108: 2444-2449Crossref PubMed Scopus (140) Google Scholar, 36Addona T.A. Shi X. Keshishian H. Mani D.R. Burgess M. Gillette M.A. Clauser K.R. Shen D. Lewis G.D. Farrell L.A. Fifer M.A. Sabatine M.S. Gerszten R.E. Carr S.A. A pipeline that integrates the discovery and verification of plasma protein biomarkers reveals candidate markers for cardiovascular disease.Nat. Biotechnol. 2011; 29: 635-643Crossref PubMed Scopus (202) Google Scholar, 37Whiteaker J.R. Lin C. Kennedy J. Hou L. Trute M. Sokal I. Yan P. Schoenherr R.M. Zhao L. Voytovich U.J. Kelly-Spratt K.S. Krasnoselsky A. Gafken P.R. Hogan J.M. Jones L.A. Wang P. Amon L. Chodosh L.A. Nelson P.S. McIntosh M.W. Kemp C.J. Paulovich A.G. A targeted proteomics-based pipeline for verification of biomarkers in plasma.Nat. Biotech. 2011; 29: 625-634Crossref PubMed Scopus (291) Google Scholar, 38Domanski D. Percy A.J. Yang J. Chambers A.G. Hill J.S. Freue G.V. Borchers C.H. MRM-based multiplexed quantitation of 67 putative cardiovascular disease biomarkers in human plasma.Proteomics. 2012; 12: 1222-1243Crossref PubMed Scopus (172) Google Scholar, 39Pan S. Chen R. Brand R.E.. Hawley S. Tamura Y. Gafken P.R. Milless B.P. Goodlett D.R. Rush J. Brentnall T.A. Multiplex targeted proteomic assay for biomarker detection in plasma: A pancreatic cancer biomarker case study.J. Proteome Res. 2012; 11: 1937-1948Crossref PubMed Scopus (73) Google Scholar, 40Huttenhain R. Soste M. Selevsek N. Rost H. Sethi A. Carapito C.. Farrah T. Deutsch E.W. Kusebauch U. Moritz R.L. Nimeus-Malmstrom E. Rinner O. Aebersold R. Reproducible quantification of cancer-associated proteins in body fluids using targeted proteomics.Sci. Transl. Med. 2012; 4: 1-13Crossref Scopus (208) Google Scholar, 41Kushnir M.M. Rockwood A.L. Roberts W.L. Abraham D. Hoofnagle A.N. Meikle A.W. Measurement of thyroglobulin by liquid chromatography-tandem mass spectrometry in serum and plasma in the presence of antithyroglobulin autoantibodies.Clinical Chemistry. 2013; 59: 982-990Crossref PubMed Scopus (141) Google Scholar, 42Neubert H. Muirhead D. Kabir M. Grace C. Cleton A. Arends R. Sequential protein and peptide immunoaffinity capture for mass spectrometry-based quantification of total human beta-nerve growth factor.Anal. Chem. 2013; 85: 1719-1726Crossref PubMed Scopus (100) Google Scholar). This approach, adopted from the field of small molecule quantitative analysis, is known as Stable Isotope Dilution (43Rifai N. Gillette M.A. Carr S.A. Protein biomarker discovery and validation: the long and uncertain path to clinical utility.Nat. Biotechnol. 2006; 24: 971-983Crossref PubMed Scopus (1367) Google Scholar, 44Brun V. Masselon C. Garin J. Dupuis A. Isotope dilution strategies for absolute quantitative proteomics.J. Proteomics. 2009; 72: 740-749Crossref PubMed Scopus (262) Google Scholar). In Tier 1, best practice would dictate the use of stable isotope-labeled internal standards for each target analyte. Labeled analog proteins can also be used as internal standards if properly characterized and validated. Internal standards are ideally included to control for the fate of analytes through the analytical process, which enables more precise quantification. Assay precision can be strongly affected by variations in sample processing, especially by the enzymatic digestion conditions used (31Addona T.A. Abbatiello S.E. Schilling B. Skates S.J. Mani D.R. Bunk D.M. Spiegelman C.H. Zimmerman L.J. Ham A.J.L. Keshishian H. Hall S.C. Allen S. Blackman R.K. Borchers C.H. Buck C. Cardasis H.L. Cusack M.P. Dodder N.G. Gibson B.W. Held J.M. Hiltke T. Jackson A. Johansen E.B. Kinsinger C.R. Li J. Mesri M. Neubert T.A. Niles R.K. Pulsipher T.C. Ransohoff D. Rodriguez H. Rudnick P.A. Smith D. Tabb D.L. Tegeler T.J. Variyath A.M. Vega-Montoto L.J. Wahlander A. Waldemarson S. Wang M. Whiteaker J.R. Zhao L. Anderson N.L. Fisher S.J. Liebler D.C. Paulovich A.G. Regnier F.E. Tempst P. Carr S.A. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma.Nat. Biotechnol. 2009; 27: 633-685Crossref PubMed Scopus (862) Google Scholar, 45Kuzyk M.A. Smith D. Yang J.C. Cross T.J. Jackson A.M. Hardie D.B. Anderson N.L. Borchers C.H. Multiple reaction monitoring-based, multiplexed, absolute quantitation of 45 proteins in human plasma.Mol. Cell. Proteomics. 2009; 8: 1860-1877Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (444) Google Scholar, 46Shuford C.M. Sederoff R.R. Chiang V.L. Muddiman D.C. Peptide production and decay rates affect the quantitative accuracy of protein cleavage isotope dilution mass spectrometry (PC-IDMS).Mol. Cell. Proteomics. 2012; 11: 814-823Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (61) Google Scholar). Good precision can only be obtained when these conditions are carried out reproducibly. Peptide concentrations are derived by measurement of the peak area ratios of one or more of the fragment ions from the labeled internal standard and the endogenous peptide. Stable isotope-labeled peptides provide this added measure of confidence as they (1) co-elute with the targeted analytes, (2) fragment to yield the corresponding, mass-shifted peptide backbone fragment ions, (3) have (in the absence of interference) identical relative abundances of the fragment ions as the endogenous peptide, and (4) compensate for ion suppression and poor spray stability (47Matuszewski B.K. Constanzer M.L. Chavez-Eng C.M. Matrix effect in quantitative LC/MS/MS analyses of biological fluids: a method for determination of finasteride in human plasma at picogram per milliliter concentrations.Anal. Chem. 1998; 70: 882-889Crossref PubMed Scopus (864) Google Scholar, 48King R. Bonfiglio R. Fernandez-Metzler C. Miller-Stein C. Olah T. Mechanistic investigation of ionization suppression in electrospray ionization.J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2000; 11: 942-950Crossref PubMed Scopus (941) Google Scholar, 49Abbatiello S.E. Mani D.R. Keshishian H. Carr S.A. Automated Detection of inaccurate and imprecise transitions in quantitative assays of peptides by multiple monitoring mass spectrometry.Clin. Chem. 2010; 56: 291-305Crossref PubMed Scopus (166) Google Scholar, 50Reiter L. Rinner O. Picotti P. Hüttenhain R. Beck M. Brusniak M.Y. Hengartner M.O. Aebersold R. mProphet: automated data processing and statistical validation for large-scale SRM experiments.Nat. Methods. 2011; 8: 430-435Crossref PubMed Scopus (365) Google Scholar, 51Keshishian H. Addona T. Burgess M. Mani D.R. Shi X. Kuhn E. Sabatine M.S. Gerszten R.E. Carr S.A. Quantification of cardiovascular biomarkers in patient plasma by targeted mass spectrometry and stable isotope dilution.Mol. Cell. Proteomics. 2009; 8: 2339-2349Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (254) Google Scholar). Ion suppression is an insidious problem caused by other matrix components (lipids and other small molecules, peptides, salts, etc.) that co-elute and compete with the analyte of interest for ionization. Ion suppression results in a decrease in the ion current detected for the same amount of analyte analyzed from different samples. Ideally, the internal standard has the same structure as the analyte and co-e