Accurate pathological diagnosis is crucial for optimal management of patients with cancer. For the approximately 100 known tumour types of the central nervous system, standardization of the diagnostic process has been shown to be particularly challenging-with substantial inter-observer variability in the histopathological diagnosis of many tumour types. Here we present a comprehensive approach for the DNA methylation-based classification of central nervous system tumours across all entities and age groups, and demonstrate its application in a routine diagnostic setting. We show that the availability of this method may have a substantial impact on diagnostic precision compared to standard methods, resulting in a change of diagnosis in up to 12% of prospective cases. For broader accessibility, we have designed a free online classifier tool, the use of which does not require any additional onsite data processing. Our results provide a blueprint for the generation of machine-learning-based tumour classifiers across other cancer entities, with the potential to fundamentally transform tumour pathology.

A method of in situ hybridization for visualizing individual human chromosomes from pter to qter, both in metaphase spreads and interphase nuclei, is reported. DNA inserts from a single chromosomal library are labeled with biotin and partially preannealed with a titrated amount of total human genomic DNA prior to hybridization with cellular or chromosomal preparations. The cross-hybridization of repetitive sequences to nontargeted chromosomes can be markedly suppressed under appropriate preannealing conditions. The remaining single-stranded DNA is hybridized to specimens of interest and detected with fluorescent or enzymelabeled avidin conjugates following post-hybridization washes. DNA inserts from recombinant libraries for chromosomes 1, 4, 7, 8, 13, 14, 18, 20, 21, 22, and X were assessed for their ability to decorate specifically their cognate chromosome; most libraries proved to be highly specific. Quantitative densitometric analyses indicated that the ratio of specific to nonspecific hybridization signal under optimal preannealing conditions was at least 8:1. Interphase nuclei showed a cohesive territorial organization of chromosomal domains, and laserscanning confocal fluorescence microscopy was used to aid the 3-D visualization of these domains. This method should be useful for both karyotypic studies and for the analysis of chromosome topography in interphase cells.

Article17 January 2012free access A novel pathway combining calreticulin exposure and ATP secretion in immunogenic cancer cell death Abhishek D Garg Abhishek D Garg Cell Death Research and Therapy Unit, Department of Cellular and Molecular Medicine KU Leuven, KU Leuven, Leuven, Belgium Search for more papers by this author Dmitri V Krysko Dmitri V Krysko Molecular Signaling and Cell Death Unit, Department for Molecular Biomedical Research, VIB, Ghent, Belgium Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University, Ghent, Belgium Search for more papers by this author Tom Verfaillie Tom Verfaillie Cell Death Research and Therapy Unit, Department of Cellular and Molecular Medicine KU Leuven, KU Leuven, Leuven, Belgium Search for more papers by this author Agnieszka Kaczmarek Agnieszka Kaczmarek Molecular Signaling and Cell Death Unit, Department for Molecular Biomedical Research, VIB, Ghent, Belgium Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University, Ghent, Belgium Search for more papers by this author Gabriela B Ferreira Gabriela B Ferreira Laboratory for Experimental Medicine and Endocrinology (LEGENDO), Department of Clinical and Experimental Medicine, KU Leuven, Leuven, Belgium Search for more papers by this author Thierry Marysael Thierry Marysael Laboratory for Pharmaceutical Biology, Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, KU Leuven, Leuven, Belgium Search for more papers by this author Noemi Rubio Noemi Rubio Cell Death Research and Therapy Unit, Department of Cellular and Molecular Medicine KU Leuven, KU Leuven, Leuven, Belgium Search for more papers by this author Malgorzata Firczuk Malgorzata Firczuk Department of Immunology, Centre of Biostructure Research, Medical University of Warsaw, Warsaw, Poland Department 3, Institute of Physical Chemistry, Polish Academy of Sciences, Warsaw, Poland Search for more papers by this author Chantal Mathieu Chantal Mathieu Laboratory for Experimental Medicine and Endocrinology (LEGENDO), Department of Clinical and Experimental Medicine, KU Leuven, Leuven, Belgium Search for more papers by this author Anton J M Roebroek Anton J M Roebroek Experimental Mouse Genetics, Department of Human Genetics, KU Leuven, Leuven, Belgium Search for more papers by this author Wim Annaert Wim Annaert Laboratory for Membrane Trafficking, Department of Human Genetics, KU Leuven and VIB-Center for the Biology of Disease, Leuven, Belgium Search for more papers by this author Jakub Golab Jakub Golab Department of Immunology, Centre of Biostructure Research, Medical University of Warsaw, Warsaw, Poland Department 3, Institute of Physical Chemistry, Polish Academy of Sciences, Warsaw, Poland Search for more papers by this author Peter de Witte Peter de Witte Laboratory for Pharmaceutical Biology, Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, KU Leuven, Leuven, Belgium Search for more papers by this author Peter Vandenabeele Peter Vandenabeele Molecular Signaling and Cell Death Unit, Department for Molecular Biomedical Research, VIB, Ghent, Belgium Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University, Ghent, Belgium Search for more papers by this author Patrizia Agostinis Corresponding Author Patrizia Agostinis Cell Death Research and Therapy Unit, Department of Cellular and Molecular Medicine KU Leuven, KU Leuven, Leuven, Belgium Search for more papers by this author Abhishek D Garg Abhishek D Garg Cell Death Research and Therapy Unit, Department of Cellular and Molecular Medicine KU Leuven, KU Leuven, Leuven, Belgium Search for more papers by this author Dmitri V Krysko Dmitri V Krysko Molecular Signaling and Cell Death Unit, Department for Molecular Biomedical Research, VIB, Ghent, Belgium Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University, Ghent, Belgium Search for more papers by this author Tom Verfaillie Tom Verfaillie Cell Death Research and Therapy Unit, Department of Cellular and Molecular Medicine KU Leuven, KU Leuven, Leuven, Belgium Search for more papers by this author Agnieszka Kaczmarek Agnieszka Kaczmarek Molecular Signaling and Cell Death Unit, Department for Molecular Biomedical Research, VIB, Ghent, Belgium Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University, Ghent, Belgium Search for more papers by this author Gabriela B Ferreira Gabriela B Ferreira Laboratory for Experimental Medicine and Endocrinology (LEGENDO), Department of Clinical and Experimental Medicine, KU Leuven, Leuven, Belgium Search for more papers by this author Thierry Marysael Thierry Marysael Laboratory for Pharmaceutical Biology, Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, KU Leuven, Leuven, Belgium Search for more papers by this author Noemi Rubio Noemi Rubio Cell Death Research and Therapy Unit, Department of Cellular and Molecular Medicine KU Leuven, KU Leuven, Leuven, Belgium Search for more papers by this author Malgorzata Firczuk Malgorzata Firczuk Department of Immunology, Centre of Biostructure Research, Medical University of Warsaw, Warsaw, Poland Department 3, Institute of Physical Chemistry, Polish Academy of Sciences, Warsaw, Poland Search for more papers by this author Chantal Mathieu Chantal Mathieu Laboratory for Experimental Medicine and Endocrinology (LEGENDO), Department of Clinical and Experimental Medicine, KU Leuven, Leuven, Belgium Search for more papers by this author Anton J M Roebroek Anton J M Roebroek Experimental Mouse Genetics, Department of Human Genetics, KU Leuven, Leuven, Belgium Search for more papers by this author Wim Annaert Wim Annaert Laboratory for Membrane Trafficking, Department of Human Genetics, KU Leuven and VIB-Center for the Biology of Disease, Leuven, Belgium Search for more papers by this author Jakub Golab Jakub Golab Department of Immunology, Centre of Biostructure Research, Medical University of Warsaw, Warsaw, Poland Department 3, Institute of Physical Chemistry, Polish Academy of Sciences, Warsaw, Poland Search for more papers by this author Peter de Witte Peter de Witte Laboratory for Pharmaceutical Biology, Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, KU Leuven, Leuven, Belgium Search for more papers by this author Peter Vandenabeele Peter Vandenabeele Molecular Signaling and Cell Death Unit, Department for Molecular Biomedical Research, VIB, Ghent, Belgium Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University, Ghent, Belgium Search for more papers by this author Patrizia Agostinis Corresponding Author Patrizia Agostinis Cell Death Research and Therapy Unit, Department of Cellular and Molecular Medicine KU Leuven, KU Leuven, Leuven, Belgium Search for more papers by this author Author Information Abhishek D Garg1, Dmitri V Krysko2,3, Tom Verfaillie1, Agnieszka Kaczmarek2,3, Gabriela B Ferreira4, Thierry Marysael5, Noemi Rubio1, Malgorzata Firczuk6,7, Chantal Mathieu4, Anton J M Roebroek8, Wim Annaert9, Jakub Golab6,7, Peter de Witte5, Peter Vandenabeele2,3 and Patrizia Agostinis 1 1Cell Death Research and Therapy Unit, Department of Cellular and Molecular Medicine KU Leuven, KU Leuven, Leuven, Belgium 2Molecular Signaling and Cell Death Unit, Department for Molecular Biomedical Research, VIB, Ghent, Belgium 3Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University, Ghent, Belgium 4Laboratory for Experimental Medicine and Endocrinology (LEGENDO), Department of Clinical and Experimental Medicine, KU Leuven, Leuven, Belgium 5Laboratory for Pharmaceutical Biology, Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, KU Leuven, Leuven, Belgium 6Department of Immunology, Centre of Biostructure Research, Medical University of Warsaw, Warsaw, Poland 7Department 3, Institute of Physical Chemistry, Polish Academy of Sciences, Warsaw, Poland 8Experimental Mouse Genetics, Department of Human Genetics, KU Leuven, Leuven, Belgium 9Laboratory for Membrane Trafficking, Department of Human Genetics, KU Leuven and VIB-Center for the Biology of Disease, Leuven, Belgium *Corresponding author. Department of Cellular and Molecular Medicine, Faculty of Medicine, University of Leuven (KU Leuven), Campus Gasthuisberg O&N1, Herestraat 49, Box 901, 3000 Leuven, Belgium. Tel.: +32 16 345715; Fax: +32 16 345995; E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2012)31:1062-1079https://doi.org/10.1038/emboj.2011.497 There is a Have you seen? (March 2012) associated with this Article. PDFDownload PDF of article text and main figures. Peer ReviewDownload a summary of the editorial decision process including editorial decision letters, reviewer comments and author responses to feedback. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info Surface-exposed calreticulin (ecto-CRT) and secreted ATP are crucial damage-associated molecular patterns (DAMPs) for immunogenic apoptosis. Inducers of immunogenic apoptosis rely on an endoplasmic reticulum (ER)-based (reactive oxygen species (ROS)-regulated) pathway for ecto-CRT induction, but the ATP secretion pathway is unknown. We found that after photodynamic therapy (PDT), which generates ROS-mediated ER stress, dying cancer cells undergo immunogenic apoptosis characterized by phenotypic maturation (CD80high, CD83high, CD86high, MHC-IIhigh) and functional stimulation (NOhigh, IL-10absent, IL-1βhigh) of dendritic cells as well as induction of a protective antitumour immune response. Intriguingly, early after PDT the cancer cells displayed ecto-CRT and secreted ATP before exhibiting biochemical signatures of apoptosis, through overlapping PERK-orchestrated pathways that require a functional secretory pathway and phosphoinositide 3-kinase (PI3K)-mediated plasma membrane/extracellular trafficking. Interestingly, eIF2α phosphorylation and caspase-8 signalling are dispensable for this ecto-CRT exposure. We also identified LRP1/CD91 as the surface docking site for ecto-CRT and found that depletion of PERK, PI3K p110α and LRP1 but not caspase-8 reduced the immunogenicity of the cancer cells. These results unravel a novel PERK-dependent subroutine for the early and simultaneous emission of two critical DAMPs following ROS-mediated ER stress. Introduction Current anticancer regimens mediate killing of tumour cells mainly by activating apoptosis, an immunosuppressive or even tolerogenic cell death process. However, it has recently emerged that a selected class of cytotoxic agents (e.g., anthracyclines) can cause tumour cells to undergo an immunogenic form of apoptosis and these dying tumour cells can induce an effective antitumour immune response (Locher et al, 2010). Immunogenic apoptosis of cancer cells displays the main biochemical hallmarks of ‘tolerogenic’ apoptosis: phosphatidylserine exposure, caspase activation, and mitochondrial depolarization. However, this type of cell death also seems to have two other important properties: (1) surface exposure or secretion of critical ‘immunogenic signals’ that fall in the category of damage-associated molecular patterns (DAMPs; Zitvogel et al, 2010a) and (2) the ability to elicit a protective immune response against tumour cells (Obeid et al, 2007; Green et al, 2009; Garg et al, 2010b; Zitvogel et al, 2010b). Several DAMPs have recently been identified as crucial for immunogenic apoptosis. These include surface calreticulin (ecto-CRT), surface HSP90 (ecto-HSP90), and secreted ATP (Spisek et al, 2007; Kepp et al, 2009). Ecto-CRT has been shown to act primarily as an ‘eat me’ signal (Gardai et al, 2005), presumably essential for priming the innate immune system, since depletion of CRT by siRNA knockdown averts the immunogenicity of cancer cell death (Obeid et al, 2007). Similarly, bortezomib-induced ecto-HSP90 exposure is crucial for immunogenic death of tumour cells and their subsequent contact with dendritic cells (DCs; Spisek et al, 2007). On the other hand, secreted ATP acts either as a ‘find me’ signal or as an activator of the NLRP3 inflammasome (Elliott et al, 2009; Ghiringhelli et al, 2009). However, while the signalling pathways governing surface exposure of CRT have been delineated to some extent (Panaretakis et al, 2009), insufficient information exists on the molecular pathway behind ATP secretion. Finally, immunogenic apoptosis is sometimes associated with disappearance of certain surface-associated molecules, for example CD47, which are referred to as ‘do not eat me’ signals (Chao et al, 2010). One common feature of all immunogenic apoptosis-inducing stimuli so far identified is induction of endoplasmic reticulum (ER) stress (Panaretakis et al, 2009; Garg et al, 2010b; Zitvogel et al, 2010b). Importantly, in the case of ecto-CRT triggered by anthracyclines, both ER stress and reactive oxygen species (ROS) production have been found to be mandatory (Panaretakis et al, 2009). However, anthracyclines suffer from dose-limiting side effects (Minotti et al, 2004; Vergely et al, 2007). Moreover, ROS production is neither a primary effect of anthracyclines nor predominantly ER directed, which makes the anthracycline-induced ‘ROS-based’ ER stress less effective and secondary in nature (Minotti et al, 2004; Vergely et al, 2007). Thus, we envisaged that one way of improving the immunogenicity of dying cancer cells is by using a therapeutic approach that can generate strong ROS-dependent ER stress as a primary effect (Garg et al, 2011). We hypothesized that photodynamic therapy (PDT; Agostinis et al, 2011) might fit the criterion of primary ER-directed ROS production. PDT can induce oxidative stress at certain subcellular sites by activating organelle-associated photosensitizers (Castano et al, 2006; Buytaert et al, 2007). Once excited by visible light and in the presence of oxygen, photosensitizers can generate organelle-localized ROS that can cause lethal damage to the cells (Agostinis et al, 2002). Additionally, this ROS-based anticancer therapy can also cause ‘emission’ of DAMPs and activate the host immune system (Korbelik et al, 2005; Garg et al, 2010a). To test this hypothesis, we used the ER-associated photosensitizer, hypericin. When it is activated by light, it causes a ROS-mediated loss-of-function of SERCA2 with consequent disruption of ER-Ca2+ homeostasis, followed by BAX/BAK-based mitochondrial apoptosis (Buytaert et al, 2006). This photo-oxidative ER stress (phox-ER stress) is accompanied by transcriptional upregulation of components of the unfolded protein response (UPR) and by changes in the expression of various genes coding for immunomodulatory proteins (Buytaert et al, 2008; Garg et al, 2010a). We report here that phox-ER stress induces immunogenic apoptosis in treated cancer cells. Early after phox-ER stress and largely preceding phosphatidylserine externalization, cancer cells mobilize CRT at the surface and secrete ATP through an overlapping PERK- and phosphoinositide 3-kinase (PI3K)-mediated mechanism, which is dissociated from caspase signalling. Intriguingly, we found that LRP1 is required for the docking of ecto-CRT. Results Phox-ER stress causes cancer cells to undergo immunogenic apoptosis At the outset, we decided to investigate whether cancer cells dying in response to phox-ER stress (Hyp-PDT based; unless otherwise mentioned) can activate human immature DCs (hu-iDCs). We used phox-ER stress (Supplementary Figure S1) mediated apoptosis-inducing conditions reported in our previous studies (Hendrickx et al, 2003; Buytaert et al, 2006) generating ∼87% of cell death of the human bladder carcinoma T24 cells within 24 h (Supplementary Figure S2). T24 cells subjected to Hyp-PDT underwent phagocytic interactions with hu-iDCs (Figure 1A). They were also phagocytosed by Mf4/4 phagocytes preferentially over untreated T24 cells (Supplementary Figure S3). Moreover, these Hyp-PDT-treated dying T24 cells induced phenotypic maturation of hu-iDCs, as indicated by surface upregulation of MHC class II (HLA-DR) and co-stimulatory CD80, CD83 and CD86 molecules (Figure 1B; Supplementary Figure S4A and B). The significant surface expression of these molecules was similar to that induced by lipopolysaccharide (LPS), a known pathogen-associated molecular pattern (PAMP) (Figure 1B; Supplementary Figure S4A and B). In contrast, freeze-thawed T24 cells undergoing accidental necrosis (AN) did not strongly stimulate DC maturation (Figure 1B; Supplementary Figure S4A and B). These findings rule out the possibility that AN might be responsible for the increased DC maturation seen against phox-ER stressed cells. Figure 1.Tumour cells dying under phox-ER stress conditions induce DC maturation and activate the adaptive immune system. (A) In-vitro phagocytosis of T24 cells treated with Hyp-PDT (red) by human immature dendritic cells (hu-iDCs) (green). The confocal fluorescence images show various phagocytic interactions between dying T24 cells and hu-iDCs, such as tethering (a), initiation of engulfment by extending the pseudopodia (b), and final stages of engulfment (c); scale bar=20 μm. (B) Human DC maturation analysis. T24 cells were left untreated (CNTR), freeze/thawed (accidental necrosis=AN), or treated with a high PDT dose. They were then co-incubated with hu-iDCs. As a positive control, hu-iDCs were stimulated with LPS for 24 h. After co-incubation, the cells were immunostained in two separate groups for CD80/CD83 positivity and CD86/HLA-DR positivity and scored by FACS analysis. Data have been normalized to the ‘CNTR T24 + hu-iDCs’ values. Fold change values are means of two independent experiments (two replicate determinations in each)±s.e.m. (*P<0.05, versus ‘CNTR T24+hu-iDCs’). (C, D) Cytokine and respiratory burst patterns exhibited by human DCs. The T24-hu-iDC co-incubation conditioned media obtained during the experiments detailed in (B) were recuperated followed by analysis for concentrations of nitrite (solubilized form of nitric oxide or NO) (C), and IL-10 (D). Absolute concentrations are the means of two independent experiments (four replicate determinations in each)±s.d. (*P<0.05 versus hu-iDC only). (E) Priming of adaptive immune system by dead/dying CT26 cells. Following immunization with PBS (CNTR) or with CT26 cells treated with tunicamycin (TUN), mitoxantrone (MTX) and the highest PDT dose, the mice were rechallenged with live CT26 tumour cells. Subsequently, the percentage of mice with tumour-free rechallenge site was determined (n represents the number of mice). Download figure Download PowerPoint To get further insight into the functional status of DCs, we evaluated the pattern of certain cytokines including the generation of nitric oxide (NO) as a marker for respiratory burst (Stafford et al, 2002). We compared DCs exposed to Hyp-PDT-treated T24 cells with those exposed to LPS or T24 cells dying following AN. We found that hu-iDCs exposed to Hyp-PDT-treated cancer cells displayed a distinguished pattern of functional activation characterized by NOhigh, IL-10absent (Figure 1C and D). This was clearly different from that induced by accidental necrotic cells (NOhigh, IL-10high) or by LPS (NOlow, IL-10low) (Figure 1C and D). Interestingly, LPS and especially accidental necrotic cells stimulated the production of IL-10 (Figure 1D), whereas Hyp-PDT-treated cells failed to stimulate the production of this immunosuppressive cytokine (Kim et al, 2006; Zitvogel et al, 2006) by hu-iDCs. To investigate the ability of cancer cells undergoing phox-ER stress to activate the adaptive immune system, we carried out in-vivo experiments in immunocompetent BALB/c mice. Before initiating the in-vivo experiments, we optimized the mouse colon carcinoma CT26 cell line for Hyp-PDT-induced apoptosis (Supplementary Figure S5) and ER stress (Supplementary Figure S1). As observed previously in other cells (Hendrickx et al, 2003; Buytaert et al, 2006), hypericin colocalized strongly with ER Tracker (Supplementary Figure S5A) and upon light irradiation induced not only appreciable cell killing (Supplementary Figure S5B) but also the main hallmarks of apoptosis, including caspase-3 and PARP cleavage (Supplementary Figure S5C). Furthermore, the CT26 cells exposed to Hyp-PDT were preferentially phagocytosed over untreated CT26 cells by murine JAWSII DCs (Supplementary Figure S6). Then, in the in-vivo study, we immunized BALB/c mice with Hyp-PDT-treated dying/dead CT26 cells. As positive and negative controls for immunogenic cell death, respectively, we used CT26 cells treated with the anthracycline, mitoxantrone (MTX) or tunicamycin (TN, an inhibitor of N-linked glycosylation) (Obeid et al, 2007). The immunized mice were then rechallenged with live CT26 tumour cells. Protection against tumour growth at the rechallenge site was interpreted as a sign of successful priming of the adaptive immune system (Figure 1E). Mice immunized with CT26 cells treated with MTX or Hyp-PDT showed robust signs of activation of the adaptive immune system: both procedures strongly prevented the tumour growth seen in the non-immunized mice. By contrast, most of the mice immunized with tunicamycin-treated CT26 cells experienced tumour growth after rechallenge (Figure 1E), which confirms the poor immunogenic properties of cancer cell death induced by this ER stress agent (Obeid et al, 2007). These data suggest that apoptotic cancer cells dying from phox-ER stress induced by Hyp-PDT activate the immune system, which is one of the important properties of immunogenic apoptosis. Cancer cells exposed to phox-ER stress surface expose or secrete/release immunogenic DAMPs We next analysed the surface exposure/release of CRT, secreted ATP and extracellular heat-shock proteins (i.e., HSP90 and HSP70) following phox-ER stress using three different Hyp-PDT doses—low, medium, and high PDT. Moreover, because of the reported effects of anthracyclines, MTX, and doxorubicin (DOXO) on immunogenic cell death (Obeid et al, 2007), we used them throughout the study for comparison. Ecto-CRT surface exposure, detected by immunofluorescence staining of T24 cells treated with Hyp-PDT or MTX, showed the characteristic surface ‘patches’ reported previously (Gardai et al, 2005; Obeid et al, 2007; Figure 2A). Cell surface biotinylation followed by immunoblot analysis of the isolated plasma membrane proteins derived from T24 cancer cells treated with Hyp-PDT revealed that phox-ER stress (Supplementary Figure S1) induced enhanced surface exposure of CRT (Figure 2B). This ecto-CRT preceded apoptosis-associated phosphatidylserine exposure (Supplementary Figure S2) under plasma membrane non-permeabilizing conditions (Figure 2C). On-cell western assay (Gonzalez-Gronow et al, 2007) confirmed these results (Supplementary Figure S7). In general, Hyp-PDT was observed to be superior to DOXO and MTX (Figure 2D and E), in terms of mobilizing CRT to the surface of cancer cells. Moreover, ecto-CRT was detectable as early as 30 min after Hyp-PDT and increased with time (Figure 2E). The 30-min threshold is much earlier than reported for anthracyclines (Obeid et al, 2007). This induction of ecto-CRT by Hyp-PDT was diminished in the presence of the 1O2 quencher L-histidine, thus revealing its ROS dependence (Buytaert et al, 2006; Supplementary Figure S8A). In contrast to anthracycline-induced ecto-CRT exposure (Panaretakis et al, 2008), ecto-CRT exposure following Hyp-PDT was not accompanied by co-translocation of ERp57 to the surface (Figure 2B). Figure 2.Phox-ER-stressed cancer cells expose calreticulin on the surface (ecto-CRT). (A) Immunofluorescence analysis of ecto-CRT. T24 cells were treated with MTX (1 μM for 4 h) and a high PDT dose (recovered 1 h post PDT) or left untreated (CNTR). Alternatively, some cells were saponin permeabilized. This was followed by staining with Sytox Green (exclusion dye), fixation, and immunostaining for CRT and counterstaining with DAPI; scale bar=20 μm. (B) Surface biotinylation analysis of ecto-CRT following phox-ER stress. T24 cells were treated with indicated doses of PDT. They were recovered at the indicated intervals after PDT treatment. Surface proteins were biotinylated followed by immunoblotting. In (B), (D), and (F), ‘+BIO' indicates controls exposed to buffer with biotin and ‘−BIO' indicates controls exposed to buffer without biotin (negative control). (C) Plasma membrane permeabilization kinetics following phox-ER stress. T24 cells were treated with PDT and the resulting conditioned media derived at the indicated times post-PDT were analysed for the presence of cytosolic LDH. Total LDH content was determined following Triton-based permeabilization of cells. Data are presented as percent LDH release; values are means of five replicate determinations±s.d. (*P<0.05, versus CNTR). (D) Phox-ER stress induces more ecto-CRT than anthracyclines. T24 cells were treated with PDT, DOXO (25 μM for 4 h), and MTX (1 μM for 4 h). They were recovered at the indicated intervals after PDT treatment. Surface proteins were biotinylated as described for (B). (E) Integrated band densitometric analysis of ecto-CRT. T24 cells were treated with DOXO (25 μM for 4 h), MTX (1 μM for 4 h), and PDT (dose and recovery time points are indicated); and surface proteins were resolved as detailed in (B). Following this, the ecto-CRT protein bands were quantified for the integrated band density via Image J software. Data have been normalized to the CNTR values. Fold change values are means of three independent determinations±s.e.m. (*P<0.05, versus CNTR). (F) Surface biotinylation analysis for KDEL sequence detection following phox-ER stress. CRT WT and KO MEFs were treated with a low PDT dose and surface biotinylated as mentioned in (B). Immunoblotting was done to detect the C-terminal KDEL sequence of various ER proteins (expected molecular weights are indicated). Download figure Download PowerPoint Likewise ecto-HSP90, certain ER proteins, such as calnexin (CNX), PERK and BiP were also undetectable on the surface of the cells under the same conditions that efficiently mobilized ecto-CRT (Supplementary Figure S8B). In addition, several other ER proteins have been reported to undergo translocation to the plasma membrane (Zai et al, 1999; Korbelik et al, 2005; Zhang et al, 2010). Therefore, we used cell surface biotinylation combined with immunoblotting to screen for surface-translocated proteins containing the KDEL ‘ER retrieval’ signal sequence, in wild-type (WT) and CRT−/− MEFs. Ecto-CRT (∼63 kDa) was the only protein with the KDEL sequence recognizable on the surface of Hyp-PDT-treated cells (Figure 2F). No KDEL-containing proteins were found in the plasma membrane fraction of cells lacking CRT (Figure 2F). On the other hand, KDEL sequences of ER resident proteins, such as GRP94, GRP78, ERp72 (ER resident protein 72), and PDI, were identifiable by their molecular weights in the intracellular protein fractions of WT and CRT−/− cells (Figure 2F). Overall, these results indicate that phox-ER stress does not lead to a general surface scrambling of ER proteins (luminal or membrane associated) but rather to a selective and rapid surface exposure of CRT in pre-apoptotic conditions. We next asked whether photo-oxidative stress mediated by other photosensitizers known to localize to other subcellular sites in addition to the ER were equally capable of surface-exposing CRT. To this end, we used photofrin (PF-PDT), a photosensitizer used in the clinic and known to induce phox-ER stress (Szokalska et al, 2009). Interestingly, while phox-ER stress mediated by Hyp-PDT strongly induced ecto-CRT, it was not so for PF-PDT (Supplementary Figure S8C) under similar apoptosis-inducing conditions as reported previously (Szokalska et al, 2009). This difference between Hyp-PDT and PF-PDT in ecto-CRT induction might be due to the more pronounced ER localization of hypericin when compared with photofrin (Buytaert et al, 2007; Szokalska et al, 2009; Luo et al, 2010). These data further underline the importance of a robust ER-directed oxidative stress in inducing ecto-CRT. Next, we addressed the possibility that apart from induction of ecto-CRT, Hyp-PDT-treated T24 cancer cells can secrete ATP into the extracellular environment. Analysis of the conditioned media showed that T24 cancer cells treated with Hyp-PDT secreted ATP (Figure 3A) under non-permeabilizing plasma membrane conditions (Figure 2C). Secretion of ATP preceded apoptosis-associated phosphatidylserine exposure (Supplementary Figure S2) and downregulation of the ‘do not eat me’ signal CD47 (Supplementary Figure S8D). Interestingly, at least at medium Hyp-PDT dose, the corresponding intracellular ATP content rose considerably in the pre-apoptotic stages (Figure 3B). Figure 3.Cancer cells exposed to phox-ER stress actively secrete ATP, passively release HSP70, HSP90, CRT, and induce IL-1β production in DCs. (A, B) ATP secretion following phox-ER stress. T24 cells were treated with PDT or left untreated (CNTR), and the conditioned media derived from these cells (1 h post PDT in serum-free media) were analysed for the presence of ATP (A). Simultaneously, the corresponding cells were permeabilization with saponin (1 h post PDT) followed by determination of ATP content in the lysate (B). Absolute concentrations are mean values of six replicate determinations±s.d. (*P<0.05, versus CNTR). (C) Cancer cells subjected to phox-ER stress stimulate IL-1β production in hu-iDCs. T24 cells were treated to undergo accidental necrosis (AN), or treated with a high PDT dose (recovered 24 h post PDT), and then co-incubated with hu-iDCs for 24 h. Simultaneously hu-iDCs were stimulated with LPS. After co-incubation, the co-incubation conditioned media (CCM) were analysed for the presence of IL-1β. Cytokine concentrations (in pg/ml) are means of two independent experiments (four replicate determinations in each) ±s.e.m. (*P<0.

Chromosome aberrations in two glioma cell lines were analyzed using biotinylated DNA library probes that specifically decorate chromosomes 1, 4, 7, 18 and 22 from pter to qter. Numerical changes, deletions and rearrangements of these chromosomes were radily visualized in metaphase spreads, as well as in early prophase and interphase nuclei. Complete chromosomes, deleted chromosomes and segments of translocated chromosomes were rapidly delineated in very complex karyotypes. Simultaneous hybridizations with additional subregional probes were used to further define aberrant chromosomes. Digital image analysis was used to quantitate the total complement of specific chromosomal DNAs in individual metaphase and interphase cells of each cell line. In spite of the fact that both glioma lines have been passaged in vitro for many years, an under-representation of chromosome 22 and an over-representation of chromosome 7 (specifically 7p) were observed. These observations agree with previous studies on gliomas. In addition, sequences of chromosome 4 were also found to be under-represented, especially in TC 593. These analyses indicate the power of these methods for pinpointing chromosome segments that are altered in specific types of tumors.

Defensins are endogenous antimicrobial peptides that protect the intestinal mucosa against bacterial invasion. It has been suggested that deficient defensin expression may underlie the chronic inflammation of Crohn disease (CD). The DNA copy number of the beta-defensin gene cluster on chromosome 8p23.1 is highly polymorphic within the healthy population, which suggests that the defective beta-defensin induction in colonic CD could be due to low beta-defensin–gene copy number. Here, we tested this hypothesis, using genomewide DNA copy number profiling by array-based comparative genomic hybridization and quantitative polymerase-chain-reaction analysis of the human beta-defensin 2 (HBD-2) gene. We showed that healthy individuals, as well as patients with ulcerative colitis, have a median of 4 (range 2–10) HBD-2 gene copies per genome. In a surgical cohort with ileal or colonic CD and in a second large cohort with inflammatory bowel diseases, those with ileal resections/disease exhibited a normal median HBD-2 copy number of 4, whereas those with colonic CD had a median of only 3 copies per genome (P=.008 for the surgical cohort; P=.032 for the second cohort). Overall, the copy number distribution in colonic CD was shifted to lower numbers compared with controls (P=.002 for both the surgical cohort and the cohort with inflammatory bowel diseases). Individuals with ≤3 copies have a significantly higher risk of developing colonic CD than did individuals with ⩾4 copies (odds ratio 3.06; 95% confidence interval 1.46–6.45). An HBD-2 gene copy number of <4 was associated with diminished mucosal HBD-2 mRNA expression (P=.033). In conclusion, a lower HBD-2 gene copy number in the beta-defensin locus predisposes to colonic CD, most likely through diminished beta-defensin expression. Defensins are endogenous antimicrobial peptides that protect the intestinal mucosa against bacterial invasion. It has been suggested that deficient defensin expression may underlie the chronic inflammation of Crohn disease (CD). The DNA copy number of the beta-defensin gene cluster on chromosome 8p23.1 is highly polymorphic within the healthy population, which suggests that the defective beta-defensin induction in colonic CD could be due to low beta-defensin–gene copy number. Here, we tested this hypothesis, using genomewide DNA copy number profiling by array-based comparative genomic hybridization and quantitative polymerase-chain-reaction analysis of the human beta-defensin 2 (HBD-2) gene. We showed that healthy individuals, as well as patients with ulcerative colitis, have a median of 4 (range 2–10) HBD-2 gene copies per genome. In a surgical cohort with ileal or colonic CD and in a second large cohort with inflammatory bowel diseases, those with ileal resections/disease exhibited a normal median HBD-2 copy number of 4, whereas those with colonic CD had a median of only 3 copies per genome (P=.008 for the surgical cohort; P=.032 for the second cohort). Overall, the copy number distribution in colonic CD was shifted to lower numbers compared with controls (P=.002 for both the surgical cohort and the cohort with inflammatory bowel diseases). Individuals with ≤3 copies have a significantly higher risk of developing colonic CD than did individuals with ⩾4 copies (odds ratio 3.06; 95% confidence interval 1.46–6.45). An HBD-2 gene copy number of <4 was associated with diminished mucosal HBD-2 mRNA expression (P=.033). In conclusion, a lower HBD-2 gene copy number in the beta-defensin locus predisposes to colonic CD, most likely through diminished beta-defensin expression. Crohn disease (CD [MIM 266600]) is a severe chronic inflammatory bowel disease characterized by intestinal ulceration that affects predominantly the ileum and colon.1Loftus Jr, EV Clinical epidemiology of inflammatory bowel disease: incidence, prevalence, and environmental influences.Gastroenterology. 2004; 126: 1504-1517Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2217) Google Scholar, 2Shanahan F Crohn’s disease.Lancet. 2002; 359: 62-69Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (462) Google Scholar The cause of the disease is unknown. Recent findings have suggested that the mucosal immunological reaction is directed against the resident bacterial flora rather than against tissue antigens.3Duchmann R Kaiser I Hermann E Mayet W Ewe K Meyer zum Büschenfelde K-H Tolerance exists towards resident intestinal flora but is broken in active inflammatory bowel disease.Clin Exp Immunol. 1995; 102: 448-455Crossref PubMed Scopus (830) Google Scholar This loss of tolerance to the normal flora may be due to a dysregulation of the gut mucosal immune response4Duchmann R May E Heike M Knolle P Neurath M Meyer zum Büschenfelde K-H T cell specificity and cross reactivity towards enterobacteria, Bacteroides, Bifidobacterium, and antigens from resident intestinal flora in humans.Gut. 1999; 44: 812-818Crossref PubMed Scopus (214) Google Scholar or, alternatively, a break in the antibacterial barrier where microbiota can trigger a deleterious immune response.5Fellermann K Wehkamp J Herrlinger KR Stange EF Crohn’s disease: a defensin deficiency syndrome?.Eur J Gastroenterol Hepatol. 2003; 15: 627-634Crossref PubMed Scopus (147) Google Scholar CD appears to be a consequence of both genetic and environmental influences. The 50% concordance rate in MZ twins, who often exhibit the same phenotype,6Halfvarson J Bodin L Tysk C Lindberg E Jarnerot G Inflammatory bowel disease in a Swedish twin cohort: a long-term follow-up of concordance and clinical characteristics.Gastroenterology. 2003; 124: 1767-1773Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (289) Google Scholar suggests a rather balanced impact of genetic and such environmental factors as smoking7Tobin MV Logan RF Langman MJ McConnell RB Gilmore IT Cigarette smoking and inflammatory bowel disease.Gastroenterology. 1987; 93: 316-321PubMed Google Scholar, 8Bridger S Lee JC Bjarnason I Jones JE Macpherson AJ In siblings with similar genetic susceptibility for inflammatory bowel disease, smokers tend to develop Crohn’s disease and non-smokers develop ulcerative colitis.Gut. 2002; 51: 21-25Crossref PubMed Scopus (113) Google Scholar or childhood hygiene.9Gent AE Hellier MD Grace RH Swarbrick ET Coggon D Inflammatory bowel disease and domestic hygiene in infancy.Lancet. 1994; 343: 766-767Abstract PubMed Scopus (303) Google Scholar During a genomewide search, several susceptibility loci and genes—including NOD2 (CARD15) (MIM 605956),10Hugot JP Chamaillard M Zouali H Lesage S Cezard JP Belaiche J Almer S Tysk C O’Morain CA Gassull M Binder V Finkel Y Cortot A Modigliani R Laurent-Puig P Gower-Rousseau C Macry J Colombel JF Sahbatou M Thomas G Association of NOD2 leucine-rich repeat variants with susceptibility to Crohn’s disease.Nature. 2001; 411: 599-603Crossref PubMed Scopus (4480) Google Scholar, 11Ogura Y Bonen DK Inohara N Nicolae DL Chen FF Ramos R Britton H Moran T Karaliuskas R Duerr RH Achkar JP Brant SR Bayless TM Kirschner BS Hanauer SB Nunez G Cho JH A frameshift mutation in NOD2 associated with susceptibility to Crohn’s disease.Nature. 2001; 411: 603-606Crossref PubMed Scopus (3986) Google ScholarDLG5 (MIM 604090),12Stoll M Corneliussen B Costello CM Waetzig GH Mellgard B Koch WA Rosenstiel P Albrecht M Croucher PJ Seegert D Nikolaus S Hampe J Lengauer T Pierrou S Foelsch UR Mathew CG Lagerstrom-Fermer M Schreiber S Genetic variation in DLG5 is associated with inflammatory bowel disease.Nat Genet. 2004; 36: 476-480Crossref PubMed Scopus (401) Google Scholar and OCTN (MIM 604190 and 603377)13Peltekova VD Wintle RF Rubin LA Amos CI Huang Q Gu X Newman B Van Oene M Cescon D Greenberg G Griffiths AM George-Hyslop PH Siminovitch KA Functional variants of OCTN cation transporter genes are associated with Crohn disease.Nat Genet. 2004; 36: 471-475Crossref PubMed Scopus (659) Google Scholar—have been found to be associated with CD. The best replicated is NOD2, which is involved in intracellular sensing of bacterial muramyl dipeptide, prominently expressed in macrophages and in particular small intestinal Paneth cells.14Lala S Ogura Y Osborne C Hor SY Bromfield A Davies S Ogunbiyi O Nunez G Keshav S Crohn’s disease and the NOD2 gene: a role for Paneth cells.Gastroenterology. 2003; 125: 47-57Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (446) Google Scholar, 15Ogura Y Lala S Xin W Smith E Dowds TA Chen FF Zimmermann E Tretiakova M Cho JH Hart J Greenson JK Keshav S Nunez G Expression of NOD2 in Paneth cells: a possible link to Crohn’s ileitis.Gut. 2003; 52: 1591-1597Crossref PubMed Scopus (357) Google Scholar Despite these significant advances, the multiple susceptibility loci and other genetic factors hitherto identified16Vermeire S Rutgeerts P Current status of genetics research in inflammatory bowel disease.Genes Immun. 2005; 6: 637-645PubMed Google Scholar do not satisfactorily explain the inheritance rates. The clinical syndrome of CD is variable with respect to age at diagnosis, location (small and/or large intestine), and disease behavior (inflammatory, stricturing, or penetrating disease). Therefore, these behavior parameters were used in the Vienna classification,17Gasche C Scholmerich J Brynskov J D’Haens G Hanauer SB Irvine EJ Jewell DP Rachmilewitz D Sachar DB Sandborn WJ Sutherland LR A simple classification of Crohn’s disease: report of the Working Party for the World Congresses of Gastroenterology, Vienna 1998.Inflamm Bowel Dis. 2000; 6: 8-15Crossref PubMed Scopus (1000) Google Scholar recently modified in Montreal.18Silverberg MS Satsangi J Ahmad T Arnott ID Bernstein CN Brant SR Caprilli R Colombel JF Gasche C Geboes K Jewell DP Karban A Loftus Jr, EV Pena AS Riddell RH Sachar DB Schreiber S Steinhart AH Targan SR Vermeire S Warren BF Toward an integrated clinical, molecular and serological classification of inflammatory bowel disease: report of a working party of the 2005 Montreal World Congress of Gastroenterology.Can J Gastroenterol Suppl A. 2005; 19: 5-36Google Scholar Location of disease involvement proved to be stable over time in individual patients, although the biological basis of small- versus large-intestinal involvement is unclear. NOD2 mutations have been shown to be predominantly associated with ileal disease and have been reported to be related to a relative lack of ileal Paneth-cell alpha-defensins HD-5 (MIM 600472) and HD-6 (MIM 600471).19Wehkamp J Harder J Weichenthal M Schwab M Schaffeler E Schlee M Herrlinger KR Stallmach A Noack F Fritz P Schroder JM Bevins CL Fellermann K Stange EF NOD2 (CARD15) mutations in Crohn’s disease are associated with diminished mucosal α-defensin expression.Gut. 2004; 53: 1658-1664Crossref PubMed Scopus (655) Google Scholar Defensins are endogenous antibiotic peptides that form a chemical barrier at the epithelial surface, and their relative deficiency may lead to bacterial adherence to the mucosa, slow invasion, and secondary mucosal inflammation.5Fellermann K Wehkamp J Herrlinger KR Stange EF Crohn’s disease: a defensin deficiency syndrome?.Eur J Gastroenterol Hepatol. 2003; 15: 627-634Crossref PubMed Scopus (147) Google Scholar, 20Wehkamp J Schmid M Fellermann K Stange EF Defensin deficiency, intestinal microbes, and the clinical phenotypes of Crohn’s disease.J Leukoc Biol. 2005; 77: 460-465Crossref PubMed Scopus (135) Google Scholar In contrast to ileal disease, colonic CD is characterized by an impaired induction of the epithelial beta-defensins HBD-2 (MIM 602215), HBD-3 (MIM 606611), and HBD-4.21Wehkamp J Harder J Weichenthal M Müller O Herrlinger KR Fellermann K Schröder JM Stange EF Inducible and constitutive b-defensins are differentially expressed in Crohn’s disease and ulcerative colitis.Inflamm Bowel Dis. 2003; 9: 215-223Crossref PubMed Scopus (248) Google Scholar, 22Fahlgren A Hammarstrom S Danielsson A Hammarstrom ML Increased expression of antimicrobial peptides and lysozyme in colonic epithelial cells of patients with ulcerative colitis.Clin Exp Immunol. 2003; 131: 90-101Crossref PubMed Scopus (171) Google Scholar, 23Fahlgren A Hammarstrom S Danielsson A Hammarstrom ML β-Defensin-3 and -4 in intestinal epithelial cells display increased mRNA expression in ulcerative colitis.Clin Exp Immunol. 2004; 137: 379-385Crossref PubMed Scopus (114) Google Scholar This relative deficiency of several beta-defensins is unlikely to be explained by multiple coincident mutations or other genetic alterations of all these genes. Detailed studies of the defensin locus on chromosome 8 have uncovered an extensive DNA copy number polymorphism (CNP) of a gene cluster, including, among others, the human beta-defensin genes HBD-2 (DEFB4), HBD-3 (DEFB103), and HBD-4 (DEFB104).24Hollox EJ Armour JAL Barber JCK Extensive normal copy number variation of a β-defensin antimicrobial-gene cluster.Am J Hum Genet. 2003; 73: 591-600Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (277) Google Scholar It has been shown that the number of gene copies is positively correlated with the expression of HBD-2 in leukocytes.24Hollox EJ Armour JAL Barber JCK Extensive normal copy number variation of a β-defensin antimicrobial-gene cluster.Am J Hum Genet. 2003; 73: 591-600Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (277) Google Scholar Since all these defensins were found to be coordinately underexpressed in colonic CD,21Wehkamp J Harder J Weichenthal M Müller O Herrlinger KR Fellermann K Schröder JM Stange EF Inducible and constitutive b-defensins are differentially expressed in Crohn’s disease and ulcerative colitis.Inflamm Bowel Dis. 2003; 9: 215-223Crossref PubMed Scopus (248) Google Scholar we hypothesized that this particular phenotype may be associated with a low beta-defensin gene cluster copy number. We therefore measured DNA copy number in the beta-defensin cluster in two independent cohorts with inflammatory bowel diseases and related it to mucosal HBD-2 gene expression. The patients from three separate cohorts received diagnoses, with use of the same standard criteria, in Cleveland, Stuttgart, and Vienna and were treated in specialized tertiary-care out- and inpatient centers. Patients gave their informed consent, and local ethics committees approved the study protocols. A small cohort—of patients with colonic CD (n=10) and healthy control individuals (n=10)—was recruited in Stuttgart. Their blood-derived genomic DNA was subjected to the microarray analysis described below. The exploratory cohort was a surgical group of patients who underwent surgical resection at the Cleveland Clinic for treatment of ileal or colonic Crohn disease (table 1). The confirmatory cohort were all whites with CD or ulcerative colitis (UC [MIM 191930]) who were treated at the Robert-Bosch-Hospital (Stuttgart) or the University Hospital (Vienna) (table 1). Diagnostic and (Vienna) classification criteria were the same at both European centers.17Gasche C Scholmerich J Brynskov J D’Haens G Hanauer SB Irvine EJ Jewell DP Rachmilewitz D Sachar DB Sandborn WJ Sutherland LR A simple classification of Crohn’s disease: report of the Working Party for the World Congresses of Gastroenterology, Vienna 1998.Inflamm Bowel Dis. 2000; 6: 8-15Crossref PubMed Scopus (1000) Google Scholar In this classification, L1 is defined as ileal disease only, L2 as colonic disease only, and L3 as ileal as well as colonic disease. Finally, the Stuttgart control group was combined with blood donors (n=103), individuals unaffected by inflammatory bowel disease who underwent surveillance colonoscopy (n=46), and 20 control individuals unaffected by intestinal disease from Cleveland. All colonoscopies that included biopsies were performed on patients from the Stuttgart cohort.Table 1Number of Patients in the Cohorts Examined for HBD-2 Gene Copy NumberNo. of SubjectsCohortClevelandStuttgartViennaControl20149CD:8554111 Ileal (L1)602238 Colonic (L2)251036 Ileal and colonic (L3)2237UC3837 Open table in a new tab DNA preparation, labeling, hybridization, and analysis procedures were performed as published elsewhere.25Mendrzyk F Korshunov A Toedt G Schwarz F Korn B Joos S Hochhaus A Schoch C Lichter P Radlwimmer B Isochromosome breakpoints on 17p in medulloblastoma are flanked by different classes of DNA sequence repeats.Genes Chromosomes Cancer. 2006; 45: 401-410Crossref PubMed Scopus (38) Google Scholar, 26Stange DE Radlwimmer B Schubert F Traub F Pich A Toedt G Mendrzyk F Lehmann U Eils R Kreipe H Lichter P High-resolution genomic profiling reveals association of chromosomal aberrations on 1q and 16p with histologic and genetic subgroups of invasive breast cancer.Clin Cancer Res. 2006; 12: 345-352Crossref PubMed Scopus (72) Google Scholar In brief, genomic DNA from fresh-frozen blood obtained from 10 patients with colonic CD and from 10 healthy control individuals was isolated using the Blood and Cell Culture Kit (Qiagen) following the instructions of the supplier. Sample DNA and reference DNA (pooled DNA from six healthy individuals) were labeled differentially with use of the Bioprime Labelling Kit (Invitrogen) and were hybridized on a DNA microarray consisting of ∼8,000 genomic fragments covering the human genome at a resolution of ∼0.5 Mb.27Mendrzyk F Radlwimmer B Joos S Kokocinski F Benner A Stange DE Neben K Fiegler H Carter NP Reifenberger G Korshunov A Lichter P Genomic and protein expression profiling identifies CDK6 as novel independent prognostic marker in medulloblastoma.J Clin Oncol. 2005; 23: 8853-8862Crossref PubMed Scopus (186) Google Scholar For the beta-defensin locus at 8p23.1, all additional genomic fragments that were available at the time were added to the microarray to enhance the resolution in the region of interest. The chromosomal mapping information was based on the Ensembl Genome Browser release 36.35i (December 2005). Arrays were scanned, and fluorescence intensities of all spots were filtered (intensity/local background >3; mean/median intensity <1.3; SD of genomic fragment log ratios <0.25) and were normalized blockwise. Chromosomal breakpoints delimiting regions of different copy number status were detected by GLAD (gain and loss analysis of DNA).28Hupe P Stransky N Thiery JP Radvanyi F Barillot E Analysis of array CGH data: from signal ratio to gain and loss of DNA regions.Bioinformatics. 2004; 20: 3413-3422Crossref PubMed Scopus (427) Google Scholar A TaqMan real-time PCR assay, specifically for amplification of genomic HBD-2, was established by using a specific set of amplification primers (forward 5′-CACCTGTGGTCTCCCTGGAA-3′; reverse 5′-AGCTTCTTGGCCTCCTCATG-3′) and a probe (6-FAM-ATGCTGCAAAAAG-MGB). Quantitative HBD-2 amplification data were normalized to ALB (albumin [MIM 103600]) as an internal reference gene, which was coamplified simultaneously in a single-tube biplex assay. The primers and probe for HBD-2 were designed using Primer Express software, version 1.5 (Applied Biosystems). For albumin, we used the primers and probe that were published elsewhere.29Schaeffeler E Schwab M Eichelbaum M Zanger UM CYP2D6 genotyping strategy based on gene copy number determination by TaqMan real-time PCR.Hum Mutat. 2003; 22: 476-485Crossref PubMed Scopus (137) Google Scholar Primers were purchased from MWG-Biotech, and probes were obtained from Applied Biosystems. Real-time PCR was performed using the ABI Prism 7700 sequence-detection system. Amplification reactions (25 μl each) were performed in triplicate with 20 ng of template DNA, 1× TaqMan Universal Master Mix buffer (Applied Biosystems), 300 nM of each primer, and 200 nM of each fluorogenic probe. Thermal cycling was initiated with a 2-min incubation at 50°C, followed by a first denaturation step of 10 min at 95°C and then by 40 cycles for 15 s at 95°C and for 1 min at 60°C. In each assay, a standard curve was recorded and a no-template control was included. To amplify HBD-2 and albumin in a one-tube biplex assay, limiting primer conditions were identified, to avoid competition of the two reactions. Quantification was performed by both the standard-curve method and the comparative CT (threshold cycle) method, as described elsewhere.29Schaeffeler E Schwab M Eichelbaum M Zanger UM CYP2D6 genotyping strategy based on gene copy number determination by TaqMan real-time PCR.Hum Mutat. 2003; 22: 476-485Crossref PubMed Scopus (137) Google Scholar The assay was validated with a selection of DNA samples, genotyped elsewhere (kindly provided by E. J. Hollox, Nottingham, United Kingdom), that contained 3, 4, 5, and 7 HBD-2 gene copies.24Hollox EJ Armour JAL Barber JCK Extensive normal copy number variation of a β-defensin antimicrobial-gene cluster.Am J Hum Genet. 2003; 73: 591-600Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (277) Google Scholar Frozen biopsies were disrupted in 1 ml of Trizol (Gibco BRL) until complete fragmentation occurred. Total RNA was extracted according to the supplier’s protocol. RNA quality was determined by electrophoresis and was quantified by photometry. Subsequently, 2 μg of RNA was reverse transcribed with oligo-dT primers and 200 U Superscript (Gibco BRL), according to the routine procedure. cDNA samples were subjected to real-time PCR as outlined elsewhere.21Wehkamp J Harder J Weichenthal M Müller O Herrlinger KR Fellermann K Schröder JM Stange EF Inducible and constitutive b-defensins are differentially expressed in Crohn’s disease and ulcerative colitis.Inflamm Bowel Dis. 2003; 9: 215-223Crossref PubMed Scopus (248) Google Scholar In brief, an aliquot corresponding to 50 ng of RNA was set up in a 20-μl reaction mixture containing 4 mM MgCl2, 0.5 μM of each primer (for HBD-2, forward 5′-ATCAGCCATGAGGGTCTTGT-3′ and reverse 5′-GAGACCACAGGTGCCAATTT-3′ [annealing temperature 60°C; product 172 bp]; for HBD-3, forward 5′-TGAAGCCTAGCAGCTATGAGGATC-3′ and reverse 5′- CCGCCTCTGACTCTGCAATAA-3′ [annealing temperature 62°C; product 128 bp]; for interleukin 8 [IL-8 (MIM 146930)], forward 5′-ATGACTTCCAAGCTGGCCGTGGC-3′ and reverse 5′-TCTCAGCCCTCTTCAAAAACTTC-3′ [annealing temperature touch down protocol 66°C–60°C; product 292 bp] [Sigma]) and 1× LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I Mix (Roche Molecular Biochemicals) and was loaded in capillary columns. PCR was performed for 45 cycles in a LightCycler (Roche Molecular Biochemicals). After each cycle, fluorescence emission readings reflecting the increase in PCR products were monitored and analyzed using LightCycler software (Roche Molecular Biochemicals). Exons 1 and 2 of the HBD2 gene and ∼50 bp of adjacent noncoding regions were PCR amplified from genomic DNA and were sequenced on an Applied Biosystems 3100 capillary sequencer with use of Big-Dye chemistry. The sequences of the amplification and nested sequencing primers are available on request. Statistical comparisons of copy numbers of (1) ileal and colonic subsets in the Cleveland cohort as well as (2) patients with L1, L2, and L3 UC and (3) control individuals from the European collective were performed with the (two-sided) Mann-Whitney test. Additionally, Kruskal-Wallis analysis of variance of ranks, including post hoc assessment by Dunn’s test, was performed to correct for multiple testing. Differences in copy number distribution among the clinical cohorts were assessed by the Pearson χ2 test, with continuity corrections. Again, the Mann-Whitney test was used to assess differences in HBD-2 mRNA expression with increasing HBD-2 gene copy numbers. Using an array CGH with ∼8,000 genomic fragments covering the human genome, with an average resolution of ∼0.5 Mb, we screened 10 patients with colonic CD and 10 healthy control individuals for DNA copy number variations. No gross chromosomal aberrations were present in either group (data not shown), but we detected several known regions of CNP, such as the IGHG1 gene cluster at 14q32.33 (MIM 147100) (data not shown) or the amylase gene cluster at 1p21.1 (MIM 104700) (fig. 1A). Except for the beta-defensin gene cluster at 8p23.1 (fig. 1B), however, no region showed a bias toward copy number loss or gain in patients versus controls. In the Ensembl Genome Browser (release 36.35i), the beta-defensin cluster is shown to be organized as a pair of inverted repeats separated by a sequence gap (fig. 1C). This probably represents the minimal size of the locus in humans. In the patient and control samples that showed copy number variation compared with the control DNA, the size of the variable region was always the same, covering ∼900 kb (megabase 7.1–8.0), including BAC clones RP11-278P18, RP11-1005B13, and RP11-52B19 (Clone Registry). This region contains both copies of the beta-defensin cluster but not the alpha-defensin cluster, as is shown for patient X1604 in figure 1C. When comparing the copy number profiles of the patient and control groups, it became evident that patients with CD, on average, seemed to have fewer copies than did healthy individuals. Relative to a DNA pool from 6 healthy control individuals, 8 of 10 patients with CD displayed small copy number losses, and none displayed copy number gains (fig. 1D). In control individuals, no such bias was observed (fig. 1E). The neighboring alpha-defensin gene cluster (fig. 1C), which mapped to megabase 6.76–6.90, and other beta-defensin–like loci—identified on chromosomal bands 6p12, 20q11.1, and 20p13 by sequence similarity search30Schutte BC Mitros JP Bartlett JA Walters JD Jia HP Welsh MJ Casavant TL McCray Jr, PB Discovery of five conserved β-defensin gene clusters using a computational search strategy.Proc Natl Acad Sci USA. 2002; 99: 2129-2133Crossref PubMed Scopus (425) Google Scholar—did not show any copy number variation in patients or control individuals (data not shown). Our array CGH analyses clearly indicated that low DNA copy number at the main beta-defensin locus might be connected to CD; however, the size of this initial sample was much too small for reliable correlation analysis. Furthermore, whereas array CGH is extremely useful for whole-genome scans, its quantitative performance is suboptimal at loci that are rich in low copy number DNA repeats (LCRs), such as the beta-defensin cluster. At such loci, the reported copy number ratios can be severely affected by cross-hybridization of the LCRs.25Mendrzyk F Korshunov A Toedt G Schwarz F Korn B Joos S Hochhaus A Schoch C Lichter P Radlwimmer B Isochromosome breakpoints on 17p in medulloblastoma are flanked by different classes of DNA sequence repeats.Genes Chromosomes Cancer. 2006; 45: 401-410Crossref PubMed Scopus (38) Google Scholar Therefore, we decided, as an alternative, to use quantitative PCR analysis of the HBD-2 gene to estimate the DNA copy number of the beta-defensin cluster. This HBD2 gene–specific approach was applied to a control population and to two patient cohorts, one from the United States and one from Europe (table 1). In the control population (n=169) the copy numbers had a range of 2–10 per genome, with a median number of 4 copies (fig. 2A). The numbers of control individuals who carry the median (4), below-median (<4), or above-median (>4) number of copies were about equal. Details of the copy number frequencies of all cohorts and subgroups are given in table 2.Table 2HBD-2 Gene Copy Number FrequenciesPercentage of Cohort with HBD-2 Gene Copy Number ofCohort2345678910Control: Cleveland5.015.045.025.05.05.0 Europe2.723.538.323.510.1.7.7.7Cleveland: Ileal1.736.735.020.06.7 Colonic12.060.016.08.04.0European: L15.023.343.321.71.75.0 L22.250.032.610.92.22.2 L38.532.235.615.35.13.4 UC5.333.333.314.79.32.71.3Note.—For the number of patients in these subgroups, see table 1. Open table in a new tab Note.— For the number of patients in these subgroups, see table 1. The U.S. patient cohort from the Cleveland Clinic consisted of 85 surgical patients with CD who had indications for ileal versus colonic resection. In patients with ileal resections (fig. 2B), the median number of copies was identical to that of the control group (4 copies); also, the frequency distribution of the three subgroups (with <4, with 4, and with >4 gene copy numbers) was not significantly different from that of the control group. In contrast, the majority (72%) of patients with colonic resections had a copy number <4, with a median of 3 copies (fig. 2C). The difference in copy numbers was highly significant (P=.008 [Mann-Whitney]) between the ileal and colonic subgroups with CD. This was maintained when tested by Kruskal-Wallis analysis of variance (P<.01 for both post hoc Dunn test ileal vs. colonic and colonic vs. control). Similarly, the proportion of the three copy number groups in the two subgroups with CD was significantly different (P=.018 [Pearson χ2]). An independent second cohort of European patients with CD (n=165) from Stuttgart and Vienna was classified according to the Vienna classification of location into those with ileal disease only (L1), with colonic disease only (L2), or with ileal plus colonic disease (L3). Again, ileal CD (L1) exhibited a copy number distribution similar to controls (P>.05), with a majority in the group with 4 gene copies (fig. 3). The median was 4 copies in L1 and controls compared with 3 in L2 (P=.032 and P=.001, respectively [Mann-Whitney]). Analysis of variance and post hoc test identified a significant difference between L2 and controls only (P<.05). Colonic CD only (L2) was characterized by a shift to lower copy numbers, with the majority (52%) carrying <4 copies of HBD-2 (P=.002 vs. controls; P=.037 vs. L1 [Pearson χ2]). Individuals with ≤3 copies have a significantly higher risk of developing colonic CD than do individuals with ⩾4 copies (odds ratio 3.06; 95% CI 1.46–6.45). Patients with L3 showed an intermediate distribution pattern between controls and L2, and, although the median was the normal 4 copies, the shift in distribution was significant (P=.034 [Mann-Whitney]

At the turn of this century, a few cytologists proposed the idea of a territorial organization of chromosomes in the cell nucleus of animal and plant species (Rabl 1885; Strasburger 1905; Boveri 1909) (Figs. 1A and 2A). While most of their scientific peers believed that chromosomes were temporary structures being

The immunogenicity of malignant cells has recently been acknowledged as a critical determinant of efficacy in cancer therapy. Thus, besides developing direct immunostimulatory regimens, including dendritic cell-based vaccines, checkpoint-blocking therapies, and adoptive T-cell transfer, researchers have started to focus on the overall immunobiology of neoplastic cells. It is now clear that cancer cells can succumb to some anticancer therapies by undergoing a peculiar form of cell death that is characterized by an increased immunogenic potential, owing to the emission of the so-called "damage-associated molecular patterns" (DAMPs). The emission of DAMPs and other immunostimulatory factors by cells succumbing to immunogenic cell death (ICD) favors the establishment of a productive interface with the immune system. This results in the elicitation of tumor-targeting immune responses associated with the elimination of residual, treatment-resistant cancer cells, as well as with the establishment of immunological memory. Although ICD has been characterized with increased precision since its discovery, several questions remain to be addressed. Here, we summarize and tabulate the main molecular, immunological, preclinical, and clinical aspects of ICD, in an attempt to capture the essence of this phenomenon, and identify future challenges for this rapidly expanding field of investigation.

It is now clear that medulloblastoma (MB), one of the most clinically challenging paediatric brain tumours, is not a single disease entity. Rather, it comprises four distinct molecular subgroups (Wnt pathway activated (WNT), Sonic hedgehog pathway activated (SHH), and the less well-characterised Group 3 and Group 4) [7, 15], which are highly divergent in terms of their patient demographics, underlying biology, and survival outcomes [4, 6]. These subgroups are becoming increasingly important, not only for refining the discovery of prognostic markers or therapeutic targets, but also for the design of prospective clinical trials. Patients with WNT subgroup tumours, for example, generally have a favourable prognosis, and may benefit from a reduction or omission of radiotherapy or chemotherapy to spare neurological side-effects or other toxicities, as is now being prospectively tested in upcoming trials both in North America and Europe. In contrast, patients with poor prognosis Group 3 tumours may benefit from intensification of up-front therapy. Furthermore, many new targeted therapeutics are likely to be efficacious in only one subgroup, such as smoothened inhibitors for SHH pathway-driven MB [1, 2]. A phase III clinical trial randomising SMO inhibition against standard of care in relapsed SHH-MB patients will start recruiting in mid-late 2013. A method for accurate and robust classification into tumour subgroups that is applicable to standard pathology specimens is therefore of key clinical relevance.

Zebrafish have recently emerged as an attractive in vivo model for epilepsy. Seven-day-old zebrafish larvae exposed to the GABA(A) antagonist pentylenetetrazol (PTZ) exhibit increased locomotor activity, seizure-like behavior, and epileptiform electrographic activity. A previous study showed that 12 out of 13 antiepileptic drugs (AEDs) suppressed PTZ-mediated increases in larval movement, indicating the potential utility of zebrafish as a high-throughput in vivo model for AED discovery. However, a question remained as to whether an AED-induced decrease in locomotion is truly indicative of anticonvulsant activity, as some drugs may impair larval movement through other mechanisms such as general toxicity or sedation. We therefore carried out a study in PTZ-treated zebrafish larvae, to directly compare the ability of AEDs to inhibit seizure-like behavioral manifestations with their capacity to suppress epileptiform electrographic activity. We re-tested the 13 AEDs of which 12 were previously reported to inhibit convulsions in the larval movement tracking assay, administering concentrations that did not, on their own, impair locomotion. In parallel, we carried out open-field recordings on larval brains after treatment with each AED. For the majority of AEDs we obtained the same response in both the behavioral and electrographic assays. Overall our data correlate well with those reported in the literature for acute rodent PTZ tests, indicating that the larval zebrafish brain is more discriminatory than previously thought in its response to AEDs with different modes of action. Our results underscore the validity of using the zebrafish larval locomotor assay as a rapid first-pass screening tool in assessing the anticonvulsant and/or proconvulsant activity of compounds, but also highlight the importance of performing adequate validation when using in vivo models.