Abstract DNA metabarcoding is promising for cost-effective biodiversity monitoring, but reliable diversity estimates are difficult to achieve and validate. Here we present and validate a method, called LULU, for removing erroneous molecular operational taxonomic units (OTUs) from community data derived by high-throughput sequencing of amplified marker genes. LULU identifies errors by combining sequence similarity and co-occurrence patterns. To validate the LULU method, we use a unique data set of high quality survey data of vascular plants paired with plant ITS2 metabarcoding data of DNA extracted from soil from 130 sites in Denmark spanning major environmental gradients. OTU tables are produced with several different OTU definition algorithms and subsequently curated with LULU, and validated against field survey data. LULU curation consistently improves α-diversity estimates and other biodiversity metrics, and does not require a sequence reference database; thus, it represents a promising method for reliable biodiversity estimation.

The cryptic lifestyle of most fungi necessitates molecular identification of the guild in environmental studies. Over the past decades, rapid development and affordability of molecular tools have tremendously improved insights of the fungal diversity in all ecosystems and habitats. Yet, in spite of the progress of molecular methods, knowledge about functional properties of the fungal taxa is vague and interpretation of environmental studies in an ecologically meaningful manner remains challenging. In order to facilitate functional assignments and ecological interpretation of environmental studies we introduce a user friendly traits and character database FungalTraits operating at genus and species hypothesis levels. Combining the information from previous efforts such as FUNGuild and FunFun together with involvement of expert knowledge, we reannotated 10,210 and 151 fungal and Stramenopila genera, respectively. This resulted in a stand-alone spreadsheet dataset covering 17 lifestyle related traits of fungal and Stramenopila genera, designed for rapid functional assignments of environmental studies. In order to assign the trait states to fungal species hypotheses, the scientific community of experts manually categorised and assigned available trait information to 697,413 fungal ITS sequences. On the basis of those sequences we were able to summarise trait and host information into 92,623 fungal species hypotheses at 1% dissimilarity threshold.

We have estimated phylogenies of fungus-growing termites and their associated mutualistic fungi of the genus Termitomyces using Bayesian analyses of DNA sequences. Our study shows that the symbiosis has a single African origin and that secondary domestication of other fungi or reversal of mutualistic fungi to a free-living state has not occurred. Host switching has been frequent, especially at the lower taxonomic levels, and nests of single termite species can have different symbionts. Data are consistent with horizontal transmission of fungal symbionts in both the ancestral state of the mutualism and most of the extant taxa. Clonal vertical transmission of fungi, previously shown to be common in the genus Microtermes (via females) and in the species Macrotermes bellicosus (via males) [Johnson, R. A., Thomas, R. J., Wood, T. G. & Swift, M. J. (1981) J. Nat. Hist. 15, 751–756], is derived with two independent origins. Despite repeated host switching, statistical tests taking phylogenetic uncertainty into account show a significant congruence between the termite and fungal phylogenies, because mutualistic interactions at higher taxonomic levels show considerable specificity. We identify common characteristics of fungus-farming evolution in termites and ants, which apply despite the major differences between these two insect agricultural systems. We hypothesize that biparental colony founding may have constrained the evolution of vertical symbiont transmission in termites but not in ants where males die after mating.

A phylogeny of the fungal phylum Basidiomycota is presented based on a survey of 160 taxa and five nuclear genes. Two genes, rpb2, and tef1, are presented in detail. The rpb2 gene is more variable than tef1 and recovers well-supported clades at shallow and deep taxonomic levels. The tef1 gene recovers some deep and ordinal-level relationships but with greater branch support from nucleotides compared to amino acids. Intron placement is dynamic in tef1, often lineage-specific, and diagnostic for many clades. Introns are fewer in rpb2 and tend to be highly conserved by position. When both protein-coding loci are combined with sequences of nuclear ribosomal RNA genes, 18 inclusive clades of Basidiomycota are strongly supported by Bayesian posterior probabilities and 16 by parsimony bootstrapping. These numbers are greater than produced by single genes and combined ribosomal RNA gene regions. Combination of nrDNA with amino acid sequences, or exons with third codon positions removed, produces strong measures of support, particularly for deep internodes of Basidiomycota, which have been difficult to resolve with confidence using nrDNA data alone. This study produces strong boostrap support and significant posterior probabilities for the first time for the following monophyletic groups: (1) Ustilaginomycetes plus Hymenomycetes, (2) an inclusive cluster of hymenochaetoid, corticioid, polyporoid, Thelephorales, russuloid, athelioid, Boletales, and euagarics clades, (3) Thelephorales plus the polyporoid clade, (4) the polyporoid clade, and (5) the cantharelloid clade. Strong support is also recovered for the basal position of the Dacrymycetales in the Hymenomycetidae and paraphyly of the Exobasidiomycetidae.

Abstract Recent studies report declines in biomass, abundance and diversity of terrestrial insect groups. While anthropogenic land use is one likely contributor to this decline, studies assessing land cover as a driver of insect dynamics are rare and mostly restricted in spatial scale and types of land cover. In this study, we used rooftop-mounted car nets in a citizen science project (‘InsectMobile’) to allow for large-scale geographic sampling of flying insects across Denmark and parts of Germany. Citizen scientists sampled insects along 278 10 km routes in urban, farmland and semi-natural (grassland, wetland and forest) landscapes in the summer of 2018. We assessed the importance of local to landscape-scale effects and land use intensity by relating insect biomass to land cover in buffers of 50, 250, 500 and 1000 m along the routes. We found a negative association of urban cover and a positive association of farmland on insect biomass at a landscape-scale (1000 m buffer) in both countries. In Denmark, we also found positive effects of all semi-natural land covers, i.e. grassland (largest at the landscape-scale, 1000 m), forests (largest at intermediate scales, 250 m), and wetlands (largest at the local-scale, 50 m). The negative association of insect biomass with urban land cover and positive association with farmland were not clearly modified by any variable associated with land use intensity. Our results show that land cover has an impact on flying insect biomass with the magnitude of this effect varying across spatial scales. Since we consistently found negative effects of urban land cover, our findings highlight the need for the conservation of semi-natural areas, such as wetlands, grasslands and forests, in Europe.

Summary Assessing and studying the distribution, ecology, diversity and movements of species is key in understanding environmental and anthropogenic effects on natural ecosystems. Although environmental DNA is rapidly becoming the tool of choice to assess biodiversity 1–3 there are few eDNA sample types that effectively capture terrestrial vertebrate diversity and those that do can be laborious to collect, require special permits and contain PCR inhibitory substances, which can lead to detection failure. Thus there is an urgent need for novel environmental DNA approaches for efficient and cost-effective large-scale routine monitoring of terrestrial vertebrate diversity. Here we show that DNA metabarcoding of airborne environmental DNA filtered from air can be used to detect a wide range of local vertebrate taxa. We filtered air at three localities in Copenhagen Zoo, detecting mammal, bird, amphibian and reptile species present in the zoo or its immediate surroundings. Our study demonstrates that airDNA has the capacity to complement and extend existing terrestrial vertebrate monitoring methods and could form the cornerstone of programs to assess and monitor terrestrial communities, for example in future global next generation biomonitoring frameworks 4,5 .

Abstract The current biodiversity and climate crises highlight the need for efficient tools to monitor terrestrial ecosystems. Here, we provide evidence for the use of airborne eDNA analyses as a novel method to detect terrestrial vertebrate communities in nature. Metabarcoding of 143 airborne eDNA samples collected during three days in Åmosen Nature Park, Denmark yielded 64 bird, mammal, fish and amphibian taxa, representing about a quarter of the around 210 wild terrestrial vertebrates that have been registered in the greater Åmosen area through years of compiling observational data. We provide evidence for the spatial movement and temporal patterns of airborne eDNA and for the influence of weather conditions on vertebrate detections. This study demonstrates airborne eDNA for high-resolution biomonitoring of vertebrates in terrestrial systems and elucidates its potential to guide global nature management and conservation efforts in the ongoing biodiversity crisis.

Abstract Biodiversity of soil microbiota is routinely assessed with environmental DNA-based methods, among which amplification and massive parallel sequencing of marker genes (eDNA metabarcoding) is the most common. Soil microbiota may for example be investigated in relation to biodiversity research or as a tool in forensic investigations. After sampling, the taxonomic composition of soil biotic communities may change. In order to minimize community changes after sampling, it is desirable to reduce biological activity, e.g. by freezing immediately after sampling. However, this may be impossible due to remoteness of study sites or, in forensic cases, where soil has been attached to a questioned item for protracted periods of time. Here we investigated the effect of storage duration and conditions on the assessment of the soil biota with eDNA metabarcoding. We extracted eDNA from freshly collected soil samples and again from the same samples after storage under contrasting temperature conditions. We used five different primer sets targeting bacteria, fungi, protists (cercozoans), general eukaryotes, and plants. For these groups, we quantified differences in richness, evenness and community composition. Subsequently, we tested whether we could correctly infer habitat type and original sample identity after storage using a large reference dataset. We found increased community composition differences with extended storage time and with higher storage temperature. However, for samples stored less than 28 days at a maximum of 20°C, changes were generally insignificant. Classification models could successfully assign most stored samples to their exact location of origin and correct habitat type even after weeks of storage. Even samples showing larger compositional changes generally retained the original sample as the best match (relative similarity). Our results show that for most biodiversity and forensic applications, storage of samples for days and even several weeks may not be a problem, if storage temperature does not exceed 20°C. Even after suboptimal storage conditions, significant patterns can be reproduced.

Abstract Consumers constitute the vast majority of global terrestrial biodiversity. Yet, local consumer richness is poorly understood. Plant species richness offers a simple hypothesis to how the diversification of carbon substrates may promote the diversity of arthropods and fungi. We took this one step further and used databases on plant-consumer interaction links to derive the richness of associated biota per plant species (link score). Using a species inventory of 130 sites we investigated 1) how well the link score could be predicted by plant attributes and 2) if the sum of plant species’ observed or predicted link scores could predict site richness of arthropods and macrofungi better than plant species richness alone. We found plant link scores to be positively related to plant size, abundance, nativeness and ectomycorrhizal status. Link based indices generally improved prediction of richness, stressing the importance of plants as niche space for the megadiverse groups of insects and fungi.

Abstract Wetlands are important habitats, often threatened by drainage, eutrophication and suppression of ungulate grazing. In many countries, considerable resources are spent combatting scrub encroachment. Here, we hypothesize that encroachment may benefit biodiversity – especially under eutrophic conditions where asymmetric competition among plants compromises conservation targets. We studied the effects of scrub cover, nutrient levels and soil moisture on richness of vascular plants, bryophytes, soil fungi and microbes in open and overgrown wetlands. We also tested the effect of encroachment, eutrophication and soil moisture on indicators of conservation value (red-listed species, indicator species and uniqueness). Plant and bryophyte species richness peaked at low soil fertility, whereas soil fertility promoted soil microbes. Soil fungi responded negatively to increasing soil moisture. Lidar-derived variables reflecting degree of scrub cover had predominantly positive effects on species richness measures. Conservation value indicators had a negative relationship to soil fertility and a positive to encroachment. For plant indicator species, the negative effect of high nutrient levels was offset by encroachment, supporting our hypothesis of competitive release under shade. The positive effect of soil moisture on indicator species was strong in open habitats only. Nutrient poor mires and meadows host many rare species and require conservation management by grazing and natural hydrology. On former arable lands, where restoration of infertile conditions is unfeasible, we recommend rewilding with opportunities for encroachment towards semi-open willow scrub and swamp forest, with the prospect of high species richness in bryophytes, fungi and soil microbes and competitive release in the herb layer.