Summary Regulatory changes are broadly accepted as key drivers of phenotypic divergence. However, identifying regulatory changes that underlie human-specific traits has proven very challenging. Here, we use 63 DNA methylation maps of ancient and present-day humans, as well as of six chimpanzees, to detect differentially methylated regions that emerged in modern humans after the split from Neanderthals and Denisovans. We show that genes affecting the face and vocal tract went through particularly extensive methylation changes. Specifically, we identify widespread hypermethylation in a network of face- and voice-affecting genes ( SOX9 , ACAN , COL2A1 , NFIX and XYLT1 ). We propose that these repression patterns appeared after the split from Neanderthals and Denisovans, and that they might have played a key role in shaping the modern human face and vocal tract.

Abstract Expression of one out of >1000 olfactory receptor (OR) genes is stochastic but, yet, spatially organized in stereotypic anatomical segments, or “zones”, along the dorsoventral axis of the mouse olfactory epithelium. We discovered that zonal OR expression is specified by OR chromatin structure and genome architecture during olfactory neuron differentiation. Specifically, across every zone dorsally expressed ORs have higher levels of heterochromatic marks and long-range contacts than ORs expressed ventrally. However, OR heterochromatin levels and frequency of genomic contacts between ORs gradually increase towards ventral zones. Consequently, ORs from dorsal indexes accumulate high H3K9me3/H3K79me3 enrichment and become silenced in ventral zones, while ORs from ventral indexes lack activating long-range genomic interactions and, thus, cannot be chosen in dorsal segments. This process is regulated by NFIA, B, and X gradients along the dorsoventral axis, triple deletion of which causes homeotic transformations on zonal OR expression, heterochromatin formation, and genomic compartmentalization.

Olfactory receptor (OR) choice represents an example of genetically hardwired stochasticity, where every olfactory neuron expresses one out of ~2000 OR alleles in a probabilistic, yet stereotypic fashion. Here, we show that topographic restrictions in OR expression are established in neuronal progenitors by two opposing forces: polygenic transcription and genomic silencing, both of which are influenced by dorsoventral gradients of transcription factors NFIA, B, and X. Polygenic transcription defines spatially constrained OR repertoires, among which one OR allele may be selected for singular expression later in development. Heterochromatin assembly and genomic compartmentalization preferentially eliminate from this “privileged” repertoire ORs with more dorsal expression destinations, which are ectopically transcribed in neuronal progenitors throughout the olfactory epithelium. Our experiments identify early transcription as an “epigenetic” contributor to future developmental patterning and reveal how two spatially responsive probabilistic processes act in concert to establish deterministic, precise, and reproducible territories of stochastic gene expression.