Peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPAR-γ), a member of the nuclear hormone receptor superfamily originally shown to play a critical role in adipocyte differentiation and glucose homeostasis, has recently been implicated as a regulator of cellular proliferation and inflammatory responses. Colonic epithelial cells, which express high levels of PPAR-γ protein, have the ability to produce inflammatory cytokines that may play a role in inflammatory bowel disease (IBD). We report here that PPAR-γ ligands dramatically attenuate cytokine gene expression in colon cancer cell lines by inhibiting the activation of nuclear factor-κB via an IκB-α–dependent mechanism. Moreover, thiazolidinedione ligands for PPAR-γ markedly reduce colonic inflammation in a mouse model of IBD. These results suggest that colonic PPAR-γ may be a therapeutic target in humans suffering from IBD.

TGF-β-activated kinase 1 (TAK1), a member of the MAPKKK family, is thought to be a key modulator of the inducible transcription factors NF-κB and AP-1 and, therefore, plays a crucial role in regulating the genes that mediate inflammation. Although in vitro biochemical studies have revealed the existence of a TAK1 complex, which includes TAK1 and the adapter proteins TAB1 and TAB2, it remains unclear which members of this complex are essential for signaling. To analyze the function of TAK1 in vivo, we have deleted the Tak1 gene in mice, with the resulting phenotype being early embryonic lethality. Using embryonic fibroblasts lacking TAK1, TAB1, or TAB2, we have found that TNFR1, IL-1R, TLR3, and TLR4-mediated NF-κB and AP-1 activation are severely impaired in Tak1 m/m cells, but they are normal in Tab1 -/- and Tab2 -/- cells. In addition, Tak1 m/m cells are highly sensitive to TNF-induced apoptosis. TAK1 mediates IKK activation in TNF-α and IL-1 signaling pathways, where it functions downstream of RIP1–TRAF2 and MyD88–IRAK1–TRAF6, respectively. However, TAK1 is not required for NF-κB activation through the alternative pathway following LT-β signaling. In the TGF-β signaling pathway, TAK1 deletion leads to impaired NF-κB and c-Jun N-terminal kinase (JNK) activation without impacting Smad2 activation or TGF-β-induced gene expression. Therefore, our studies suggests that TAK1 acts as an upstream activating kinase for IKKβ and JNK, but not IKKα, revealing an unexpectedly specific role of TAK1 in inflammatory signaling pathways.

Myles Brown and colleagues analyze chromatin organization of androgen receptor-responsive transcriptional enhancers in a prostate cancer cell line. The authors develop a model to identify other genomic regions showing similar dynamic changes in chromatin structure, and identify other transcription factors that are involved in cellular responses to androgen. Chromatin plays a central role in eukaryotic gene regulation. We performed genome-wide mapping of epigenetically marked nucleosomes to determine their position both near transcription start sites and at distal regulatory elements, including enhancers. In prostate cancer cells, where androgen receptor binds primarily to enhancers, we found that androgen treatment dismisses a central nucleosome present at androgen receptor binding sites that is flanked by a pair of marked nucleosomes. A new quantitative model built on the behavior of such nucleosome pairs correctly identified regions bound by the regulators of the immediate androgen response, including androgen receptor and FOXA1. More importantly, this model also correctly predicted previously unidentified binding sites for other transcription factors present after prolonged androgen stimulation, including OCT1 and NKX3-1. Therefore, quantitative modeling of enhancer structure provides a powerful predictive method to infer the identity of transcription factors involved in cellular responses to specific stimuli.

In prokaryotes, RNA derived from type I and type III CRISPR loci direct large ribonucleoprotein complexes to destroy invading bacteriophage and plasmids. In Escherichia coli, this 405-kilodalton complex is called Cascade. We report the crystal structure of Cascade bound to a single-stranded DNA (ssDNA) target at a resolution of 3.03 angstroms. The structure reveals that the CRISPR RNA and target strands do not form a double helix but instead adopt an underwound ribbon-like structure. This noncanonical structure is facilitated by rotation of every sixth nucleotide out of the RNA-DNA hybrid and is stabilized by the highly interlocked organization of protein subunits. These studies provide insight into both the assembly and the activity of this complex and suggest a mechanism to enforce fidelity of target binding.

The CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat) system is an RNA-guided immune system that protects prokaryotes from invading genetic elements. This system represents an inheritable and adaptable immune system that is mediated by multisubunit effector complexes. In the Type III-B system, the Cmr effector complex has been found to cleave ssRNA in vitro. However, in vivo, it has been implicated in transcription-dependent DNA targeting. We show here that the Cmr complex from Thermotoga maritima can cleave an ssRNA target that is complementary to the CRISPR RNA. We also show that binding of a complementary ssRNA target activates an ssDNA-specific nuclease activity in the histidine–aspartate (HD) domain of the Cmr2 subunit of the complex. These data suggest a mechanism for transcription-coupled DNA targeting by the Cmr complex and provide a unifying mechanism for all Type III systems.

ABSTRACT Post-translational modification of proteins with poly(ADP-ribose) (PAR) is an important component of the DNA damage response. Four PAR synthesis inhibitors have recently been approved for the treatment of breast, ovarian, and prostate cancers. Despite its clinical significance, a molecular understanding of PAR function, including its binding partners, remains incomplete. In this work, we synthesize a PAR photoaffinity probe that captures and isolates endogenous PAR binders. Our method identified dozens of known PAR-binding proteins and hundreds of novel binders involved in DNA repair, RNA processing, and metabolism. PAR binding by eight candidates was confirmed using pull-down and/or electrophoretic mobility shift assays. Using PAR probes of defined lengths, we detected proteins that preferentially bind to 40-mer over 8-mer PAR, indicating that polymer length may regulate the outcome and timing of PAR signaling pathways. This investigation produces the first census of PAR-binding proteins, provides a proteome-wide view of length-selective PAR binding, and associates PAR binding with RNA metabolism and the formation of biomolecular condensates.

Cas9 has made a wide range of genome engineering applications possible. However, its specificity continues to be a challenge. Non-canonical gRNAs and new engineered variants of Cas9 have been developed to improve specificity but at the cost of the on-target activity. DNA unwinding is the primary checkpoint before cleavage by Cas9 and was shown to be made more sensitive to sequence mismatches by specificity-enhancing mutations in Cas9. Here we performed single-molecule FRET-based DNA unwinding experiments using various combinations of non-canonical gRNAs and different Cas9s. All engineered Cas9s were less promiscuous than wild type when canonical gRNA was used but HypaCas9 had much-reduced on-target unwinding. Cas9-HF1 and eCas9 showed the best balance between low promiscuity and high on-target activity with canonical gRNA. When extended gRNAs with one or two guanines added were used, Sniper1-Cas9 showed the lowest promiscuity while maintaining high on-target activity. Truncated gRNA generally reduced unwinding and adding a non-matching guanine to the 5 prime end of gRNA influenced unwinding in a sequence-context dependent manner. Our results are consistent with cell-based cleavage data and provide a mechanistic understanding of how various Cas9/gRNA combinations perform in genome engineering.

Abstract Direct visualization of point mutations in situ can be informative for studying genetic diseases and nuclear biology. We describe a direct hybridization genome imaging method with single-nucleotide sensitivity, sgGOLDFISH, which leverages the high cleavage specificity of enhanced Cas9 combined with a single extended guide RNA to load a superhelicase and reveal probe binding sites through local denaturation. Using sgGOLDFISH, we identified base-editor-modified and unmodified progeroid fibroblasts from a heterogeneous population, validated the identification through progerin immunofluorescence, and demonstrated accurate sub-nuclear localization of point mutations.

CRISPR-Cas9, which imparts adaptive immunity against foreign genomic invaders in certain prokaryotes, has been repurposed for genome engineering applications. More recently, another RNA-guided CRISPR endonuclease called Cpf1 (also known as Cas12a) was identified and is also being repurposed. Little is known about the kinetics and mechanism of Cpf1 DNA interaction and how sequence mismatches between the DNA target and guide-RNA influence this interaction. We have used single-molecule fluorescence imaging and biochemical assays to characterize DNA interrogation, cleavage, and product release by three Cpf1 orthologues. Like Cas9, Cpf1 initially binds DNA in search of PAM (protospacer-adjacent motif) sequences, verifies the target sequence unidirectionally from the PAM-proximal end and rapidly rejects any targets that lack a PAM or that are poorly matched with the guide-RNA. Cpf1 requires ~17 bp sequence match for both stable binding and cleavage, contrasting it with Cas9 which requires 9 bp for stable binding and ~16 bp for cleavage. Unlike Cas9, which does not release the DNA cleavage products, Cpf1 rapidly releases the PAM-distal cleavage product, but not the PAM-proximal product. Our findings have important implications on Cpf1-based genome engineering and manipulation applications.