Abstract BACKGROUND GWAS of schizophrenia demonstrated that variations in the non-coding regions are responsible for most of common variation heritability of the disease. It is hypothesized that these risk variants alter gene expression. Thus, studying alterations in gene expression in schizophrenia may provide a direct approach to understanding the etiology of the disease. In this study we use C ultured N eural progenitor cells derived from O lfactory N euroepithelium (CNON) as a genetically unaltered cellular model to elucidate the neurodevelopmental aspects of schizophrenia. METHODS We performed a gene expression study using RNA-Seq of CNON from 111 controls and 144 individuals with schizophrenia. Differentially expressed (DEX) genes were identified with DESeq2, using covariates to correct for sex, age, library batches and one surrogate variable component. RESULTS 80 genes were DEX (FDR<10%), showing enrichment in cell migration, cell adhesion, developmental process, synapse assembly, cell proliferation and related gene ontology categories. Cadherin and Wnt signaling pathways were positive in overrepresentation test, and, in addition, many genes are specifically involved in Wnt5A signaling. The DEX genes were significantly, enriched in the genes overlapping SNPs with genome-wide significant association from the PGC GWAS of schizophrenia (PGC SCZ2). We also found substantial overlap with genes associated with other psychiatric disorders or brain development, enrichment in the same GO categories as genes with mutations de novo in schizophrenia, and studies of iPSC-derived neural progenitor cells. CONCLUSIONS CNON cells are a good model of the neurodevelopmental aspects of schizophrenia and can be used to elucidate the etiology of the disorder.

Abstract Studies using rodent models have shown that relapse to drug or food seeking increases progressively during abstinence, a phenomenon termed ‘incubation of craving’. Mechanistic studies of incubation of craving have focused on specific neurobiological targets within pre- selected brain areas. Recent methodological advances in whole-brain immunohistochemistry, clearing, and imaging now enable unbiased brain-wide cellular resolution mapping of regions and circuits engaged during learned behaviors. However, these whole brain imaging approaches were developed for mouse brains while incubation of drug craving has primarily been studied in rats and incubation of food craving has not been demonstrated in mice. Here, we established a mouse model of incubation of palatable food craving and examined food reward seeking after 1, 15, and 60 abstinence days. We then used the neuronal activity marker Fos with intact brain mapping procedures to identify corresponding patterns of brain-wide activation. Relapse to food seeking was significantly higher after 60 abstinence days than after 1 or 15 days. Using unbiased ClearMap analysis, we identified increased activation of multiple brain regions, particularly corticostriatal structures, following 60, but not 15 abstinence days. We used orthogonal SMART2 analysis to confirm these findings within corticostriatal and thalamocortical subvolumes and applied expert-guided registration to investigate subdivision and layer-specific activation patterns. Overall, we (1) identified novel brain-wide activity patterns during incubation of food seeking using complementary analytical approaches, and (2) provide a single-cell resolution whole-brain atlas that can be used to identify functional networks and global architecture underlying incubation of food craving. Significance Statement Relapse to reward seeking progressively increases during abstinence, a phenomenon termed incubation of craving. Mechanistic studies of incubation can lead to novel relapse treatments. However, previous studies have primarily used rat models and targeted region-by-region analyses and a brain-wide functional atlas of incubation of reward seeking is lacking. We established a behavioral procedure for incubation of palatable food seeking in mice and applied whole-brain activity mapping with Fos as a neuronal activity marker to identify the functional connectome of this incubation. Like rats, mice showed incubation of food seeking during abstinence. Using two complementary activity mapping approaches, we identified a brain-wide pattern of increased neural activation that mirrored incubation of food seeking after 60, but not 15, days of abstinence.

Mapping immediate early gene (IEG) expression across intact brains is becoming a popular approach for identifying the brain-wide activity patterns underlying behavior. Registering whole brains to an anatomical atlas presents a technical challenge that has predominantly been tackled using automated voxel-based registration methods; however, these methods may fail when brains are damaged or only partially imaged, can be challenging to correct, and require substantial computational power. Here we present an open source package in R called SMART (semi-manual alignment to reference templates) as an extension to the WholeBrain framework for automated segmentation and semi-automated registration of experimental images to vectorized atlas plates from the Allen Brain Institute Mouse Common Coordinate Framework (CCF). The SMART package was created with the novice programmer in mind and introduces a streamlined pipeline for aligning, registering, and segmenting large LSFM volumetric datasets with the CCF across the anterior-posterior axis, using a simple 'choice game' and interactive user-friendly menus. SMART further provides the flexibility to register partial brains or discrete user-chosen experimental images across the CCF, making it compatible with analysis of traditionally sectioned coronal brain slices. In addition to SMART, we introduce a modified tissue clearing protocol based on the iDISCO+ procedure that is optimized for uniform Fos antibody labeling and tissue clearing across whole intact mouse brains. Here we demonstrate the utility of the SMART-WholeBrain pipeline, in conjunction with the modified iDISCO+ Fos procedure, by providing example datasets alongside a full user tutorial. Finally, we present a subset of these data online in an interactive web applet. The complete SMART package is available for download on GitHub.

Recently, measurement of RNA at single cell resolution has yielded surprising insights. Methods for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) have received considerable attention, but the broad reliability of single cell methods and the factors governing their performance are still poorly known. Here, we conducted a large-scale control experiment to assess the transfer function of three scRNA-seq methods and factors modulating the function. All three methods detected greater than 70% of the expected number of genes and had a 50% probability of detecting genes with abundance greater than 2 to 4 molecules. Despite the small number of molecules, sequencing depth significantly affected gene detection. While biases in detection and quantification were qualitatively similar across methods, the degree of bias differed, consistent with differences in molecular protocol. Measurement reliability increased with expression level for all methods and we conservatively estimate the measurement transfer functions to be linear above ~5-10 molecules. Based on these extensive control studies, we propose that RNA-seq of single cells has come of age, yielding quantitative biological information.

Background: Fibrinogen-to-albumin ratio (FAR) has been proposed as a readily available inflammatory biomarker associated with coronary artery disease (CAD). However, its association with CAD severity and prognosis has predominantly been assessed in patients with acute coronary syndromes (ACS). The Leiden score is a validated comprehensive measure of CAD incorporating stenosis proximity, severity, and plaque type that independently predicts cardiovascular events. Whether FAR is associated with Leiden score or high-risk plaque features on coronary computed tomographic angiography (CCTA) in stable outpatients is unknown. Methods: Adult outpatients undergoing clinically indicated CCTA were enrolled (5/2021-9/2023) in a prospective study assessing the relationship of plaque to immune markers and provided same-day pre-scan peripheral venous blood samples. CCTAs were post-processed and analyzed by the consensus of two expert readers blinded to clinical data using a 17-segment model to determine coronary artery calcium (CAC), Leiden score, and high-risk plaque features. Patients were grouped by FAR (quartiles), Leiden score (<5, 5-20, >20), and CAC score (0, >0-100, >100-300, >300-1000, >1000). Numerical variables were compared via Wilcoxon and Kruskal-Willis tests. Spearman correlation was calculated between FAR and Leiden score. Results: Of 284 patients, 53.8% were male, 86.7% were white, and 58.8% were on a statin (Table 1). Median FAR was 70.3 mg/g, 64.0% had a non-zero CAC score, and 25.0% had at least one segment with one high-risk plaque feature. Across quartiles of FAR, there was no difference in Leiden score (5.8 (IQR: 0.0-18.5), 12.4 (3.1-20.7), 8.0 (0.0-19.9), 6.8 (0.0-21.1), p=0.50) or probability of having at least one segment with at least one (29.6%, 23.9%, 23.9%, 22.5%, p=0.69) or two (18.3%, 14.1%, 12.7%, 15.5%, p=0.66) high-risk plaque features. There was no correlation between FAR and Leiden score (R=0.03, p=0.66). There was no difference in FAR when stratified by Leiden score (Table 1, p=0.53), CAC score (Table 2, p=0.50), or number of segments with at least one high-risk plaque feature (Table 3, p=0.18). Conclusion: In a prospective cohort of adult outpatients across a wide spectrum of CAD burden with high rates of baseline statin use, FAR was not associated with CAD or presence of high-risk plaque features on CCTA. Further evaluation of its role as an inflammatory biomarker in larger populations, particularly patients without ACS, is required.