We conducted the largest investigation of predisposition variants in cancer to date, discovering 853 pathogenic or likely pathogenic variants in 8% of 10,389 cases from 33 cancer types. Twenty-one genes showed single or cross-cancer associations, including novel associations of SDHA in melanoma and PALB2 in stomach adenocarcinoma. The 659 predisposition variants and 18 additional large deletions in tumor suppressors, including ATM, BRCA1, and NF1, showed low gene expression and frequent (43%) loss of heterozygosity or biallelic two-hit events. We also discovered 33 such variants in oncogenes, including missenses in MET, RET, and PTPN11 associated with high gene expression. We nominated 47 additional predisposition variants from prioritized VUSs supported by multiple evidences involving case-control frequency, loss of heterozygosity, expression effect, and co-localization with mutations and modified residues. Our integrative approach links rare predisposition variants to functional consequences, informing future guidelines of variant classification and germline genetic testing in cancer.

SUMMARY Pancreatic Ductal Adenocarcinoma (PDAC) is a lethal disease with limited treatment options and poor survival. We studied 73 samples from 21 patients (7 treatment-naïve and 14 treated with neoadjuvant regimens), analyzing distinct spatial units and performing bulk proteogenomics, single cell sequencing, and cellular imaging. Spatial drivers, including mutant KRAS , SMAD4 , and GNAQ, were associated with differential phosphosignaling and metabolic responses compared to wild type. Single cell subtyping discovered 12 of 21 tumors with mixed basal and classical features. Trefoil factor family members were upregulated in classical populations, while the basal populations showed enhanced expression of mesenchymal genes, including VIM and IGTB1 . Acinar-ductal metaplasia (ADM) populations, present in 95% of patients, with 46% reduction of driver mutation fractions compared to tumor populations, exhibited suppressive and oncogenic features linked to morphologic states. We identified coordinated expression of TIGIT in exhausted and regulatory T cells and Nectin receptor expression in tumor cells. Higher expression of angiogenic and stress response genes in dendritic cells compared to tumor cells suggests they have a pro-tumorigenic role in remodeling the microenvironment. Treated samples contain a three-fold enrichment of inflammatory CAFs when compared to untreated samples, while other CAF subtypes remain similar. A subset of tumor and/or ADM-specific biomarkers showed differential expression between treatment groups, and several known drug targets displayed potential cross-cell type reactivities. This resolution that spatially defined single cell omics provides reveals the diversity of tumor and microenvironment populations in PDAC. Such understanding may lead to more optimal treatment regimens for patients with this devastating disease. HIGHLIGHTS Acinar-ductal metaplasia (ADM) cells represent a genetic and morphologic transition state between acinar and tumor cells. Inflammatory cancer associated fibroblasts (iCAFs) are a major component of the PDAC TME and are significantly higher in treated samples Receptor-ligand analysis reveals tumor cell-TME interactions through NECTIN4-TIGIT Tumor and ADM cell proteogenomics differ between treated and untreated samples, with unique and shared potential drug targets

ABSTRACT Advances in mass-spectrometry have generated increasingly large-scale proteomics datasets containing tens of thousands of phosphorylation sites (phosphosites) that require prioritization. We develop a bioinformatics tool called HotPho and systematically discover 3D co-clustering of phosphosites and cancer mutations on protein structures. HotPho identifies 474 such hybrid clusters containing 1,255 co-clustering phosphosites, including RET p.S904/Y928, the conserved HRAS/KRAS p.Y96, and IDH1 p.Y139/IDH2 p.Y179 that are adjacent to recurrent mutations on protein structures not found by linear proximity approaches. Hybrid clusters, enriched in histone and kinase domains, frequently include expression-associated mutations experimentally shown as activating and conferring genetic dependency. Approximately 300 co-clustering phosphosites are verified in patient samples of 5 cancer types or previously implicated in cancer, including CTNNB1 p.S29/Y30, EGFR p.S720, MAPK1 p.S142, and PTPN12 p.S275. In summary, systematic 3D clustering analysis highlights nearly 3,000 likely functional mutations and over 1,000 cancer phosphosites for downstream investigation and evaluation of potential clinical relevance.