Abstract Coronavirus disease 2019 (COVID-19) caused by SARS-CoV-2 infection presents with varied clinical manifestations 1 , ranging from mild symptoms to acute respiratory distress syndrome (ARDS) with high mortality 2,3 . Despite extensive analyses, there remains an urgent need to delineate immune cell states that contribute to mortality in severe COVID-19. We performed high-dimensional cellular and molecular profiling of blood and respiratory samples from critically ill COVID-19 patients to define immune cell genomic states that are predictive of outcome in severe COVID-19 disease. Critically ill patients admitted to the intensive care unit (ICU) manifested increased frequencies of inflammatory monocytes and plasmablasts that were also associated with ARDS not due to COVID-19. Single-cell RNAseq (scRNAseq)-based deconvolution of genomic states of peripheral immune cells revealed distinct gene modules that were associated with COVID-19 outcome. Notably, monocytes exhibited bifurcated genomic states, with expression of a cytokine gene module exemplified by CCL4 (MIP-1β) associated with survival and an interferon signaling module associated with death. These gene modules were correlated with higher levels of MIP-1β and CXCL10 levels in plasma, respectively. Monocytes expressing genes reflective of these divergent modules were also detectable in endotracheal aspirates. Machine learning algorithms identified the distinctive monocyte modules as part of a multivariate peripheral immune system state that was predictive of COVID-19 mortality. Follow-up analysis of the monocyte modules on ICU day 5 was consistent with bifurcated states that correlated with distinct inflammatory cytokines. Our data suggests a pivotal role for monocytes and their specific inflammatory genomic states in contributing to mortality in life-threatening COVID-19 disease and may facilitate discovery of new diagnostics and therapeutics.

Abstract Lymphopenia is common in severe COVID-19 disease, yet the mechanisms are poorly understood. In 148 patients with severe COVID-19, we found lymphopenia was associated with worse survival. CD4 + lymphopenia predominated, with lower CD4 + /CD8 + ratios in severe COVID-19 compared to recovered, mild disease (p<0.0001). In severe disease, immunodominant CD4 + T cell responses to Spike-1(S1) produced increased in vitro TNF-α, but impaired proliferation and increased susceptibility to activation-induced cell death (AICD). CD4 + TNF-α + T cell responses inversely correlated with absolute CD4 + counts from severe COVID-19 patients (n=76; R=-0.744, P<0.0001). TNF-α blockade including infliximab or anti-TNFRI antibodies strikingly rescued S1-specific CD4 + proliferation and abrogated S1-AICD in severe COVID-19 patients (P<0.001). Single-cell RNAseq demonstrated downregulation of Type-1 cytokines and NFκB signaling in S1-stimulated CD4 + cells with infliximab treatment. Lung CD4 + T cells in severe COVID-19 were reduced and produced higher TNF-α versus PBMC. Together, our findings show COVID-19-associated CD4 + lymphopenia and dysfunction is autocrine TNF-α/TNFRI-dependent and therapies targeting TNF-α may be beneficial in severe COVID-19. One Sentence Summary Autocrine TNF-α/TNFRI regulates CD4 + T cell lymphopenia and dysfunction in severe COVID-19 disease.

Abstract Respiratory infection by Pseudomonas aeruginosa , common in hospitalized immunocompromised and immunocompetent ventilated patients, can be life-threatening because of antibiotic resistance. This raises the question of whether the host’s immune system can be educated to combat this bacterium. Here we show that prior exposure to a single low dose of lipopolysaccharide (LPS) protects mice from a lethal infection by P. aeruginosa . LPS exposure trained the innate immune system by promoting expansion of neutrophil and interstitial macrophage populations distinguishable from other immune cells with enrichment of gene sets for phagocytosis- and cell-killing-associated genes. The cell-killing gene set in the neutrophil population uniquely expressed Lgals3 , which encodes the multifunctional antibacterial protein, galectin-3. Intravital imaging for bacterial phagocytosis, assessment of bacterial killing and neutrophil-associated galectin-3 protein levels together with use of galectin-3-deficient mice collectively highlight neutrophils and galectin-3 as central players in LPS-mediated protection. Patients with acute respiratory failure revealed significantly higher galectin-3 levels in endotracheal aspirates (ETAs) of survivors compared to non-survivors, galectin-3 levels strongly correlating with a neutrophil signature in the ETAs and a prognostically favorable hypoinflammatory plasma biomarker subphenotype. Taken together, our study provides impetus for harnessing the potential of galectin-3-expressing neutrophils to protect from lethal infections and respiratory failure.

Abstract Critical illness can significantly alter the composition and function of the human microbiome, but few studies have examined these changes over time. Here, we conduct a comprehensive analysis of the oral, lung, and gut microbiota in 479 mechanically ventilated patients (223 females, 256 males) with acute respiratory failure. We use advanced DNA sequencing technologies, including Illumina amplicon sequencing (utilizing 16S and ITS rRNA genes for bacteria and fungi, respectively, in all sample types) and Nanopore metagenomics for lung microbiota. Our results reveal a progressive dysbiosis in all three body compartments, characterized by a reduction in microbial diversity, a decrease in beneficial anaerobes, and an increase in pathogens. We find that clinical factors, such as chronic obstructive pulmonary disease, immunosuppression, and antibiotic exposure, are associated with specific patterns of dysbiosis. Interestingly, unsupervised clustering of lung microbiota diversity and composition by 16S independently predicted survival and performed better than traditional clinical and host-response predictors. These observations are validated in two separate cohorts of COVID-19 patients, highlighting the potential of lung microbiota as valuable prognostic biomarkers in critical care. Understanding these microbiome changes during critical illness points to new opportunities for microbiota-targeted precision medicine interventions.

The role of the gut microbiome in critical illness is being actively investigated, but the optimal sampling methods for sequencing studies of gut microbiota remain unknown. Stool samples are generally considered reference-standard but are not practical to obtain in the intensive care unit (ICU), and thus, rectal swabs are often used. However, the reliability of rectal swabs for gut microbiome profiling has not been established in the ICU setting. In this study, we compared 16S rRNA gene sequencing results between rectal swab and stool samples collected at three timepoints in mechanically-ventilated critically-ill adults. Rectal swabs comprised 89% of samples collected at the baseline timepoint, but stool samples became more available at later time-points. Significant differences in alpha and beta-diversity between rectal swabs and stool samples were observed, but these differences were primarily due to baseline samples. Higher relative abundance of Actinobacteria phyla (typically skin microbes) was present in rectal swabs compared to stool samples (p=0.05), a difference that was attenuated over time. The progressive similarity of rectal swabs and stool samples likely results from increasing stool coating of the rectal vault and direct soiling of the rectal swabs taken at later time points. Therefore, inferences about the role of the gut microbiome in critical illness should be drawn cautiously and take into account the actual type and timing of samples analyzed.Statement of Importance Rectal swabs have been proposed as potential alternatives to stool samples for gut microbiome profiling in outpatients or healthy adults, but their reliability in critically-ill patients has not been defined. Because stool sampling is not practical and often not feasible in the intensive care unit, we performed a detailed comparison of gut microbial sequencing profiles between rectal swabs and stool samples in a longitudinal cohort of critically-ill patients. We identified systematic differences in gut microbial profiles between rectal swabs and stool samples and demonstrated that timing of rectal swab sampling had a significant impact on sequencing results. Our methodological findings should provide valuable information for the design and interpretation of future investigations of the role of the gut microbiome in critical illness.

Abstract Background Cefiderocol (FDC) or ceftazidime-avibactam with aztreonam (CZA-ATM) are frontline agents for New Delhi metallo-β-lactamase (NDM)-producing Enterobacterales; however, clinical data are scarce, and mechanisms of treatment-emergent resistance are ill-defined. Our objectives were to characterize serial isolates and stool microbiota from a liver transplant recipient with NDM-producing Escherichia coli bacteraemia. Methods Isolates collected pre- and post-CZA–ATM treatment underwent broth microdilution susceptibility testing and whole-genome sequencing. Longitudinal stool collected during CZA–ATM therapy underwent metagenomic sequencing (Nanopore MinION). Results The baseline isolate exhibited elevated MICs for ATM–AVI (16/4 µg/mL) and FDC (8 µg/mL). Posttreatment, a rectal surveillance isolate exhibited high-level resistance to ATM–AVI (&gt; 128/4 µg/mL) and FDC (32 µg/mL). Both isolates belonged to ST361 and harboured WT blaNDM-5. The baseline isolate contained wild type (WT) blaCMY-145 and mutations in ftsI (which encodes PBP3), including a YRIN insertion at residue 338 and the non-synonymous substitutions Q227H, E353K and I536L. The posttreatment isolate harboured new mutations in ftsI (A417 V) and blaCMY-145 (L139R and N366Y). Analysis of four stool samples collected during CZA–ATM treatment revealed high E. coli abundance. E. coli relative abundance increased from 34.5% (first sample) to 61.9% (last sample). Conclusions Baseline mutations in ftsI were associated with reduced susceptibility to ATM–AVI and FDC in an ST361 NDM-5-producing E. coli bloodstream isolate. High-level resistance was selected after CZA–ATM treatment, resulting in new ftsl and blaCMY-145 mutations. These findings underscore the need for ATM–AVI susceptibility testing for NDM producers, and the potential for PBP3 mutations to confer cross-resistance to ATM–AVI and FDC, which can emerge after CZA–ATM treatment.

Abstract While there have been extensive analyses characterizing cellular and humoral responses across the severity spectrum in COVID-19, predictors of outcomes within severe COVID-19 remain to be comprehensively elucidated. Recently, we identified divergent monocyte states as predictors of outcomes within severe COVID-19, but corresponding humoral profiles of risk have not been delineated. Furthermore, the nature of antibodies (Abs) directed against viral antigens beyond the spike protein or endemic coronavirus antigens and their associations with disease severity and outcomes remain poorly defined. We performed deep molecular profiling of Abs directed against a wide range of antigenic specificities in severe COVID-19 patients admitted to the ICU. The profiles consisted of canonical (S, RBD, N) and non-canonical (orf3a, orf8, nsp3, nps13 and M) antigenic specificities. Notably, multivariate machine learning (ML) models, generated using profiles of Abs directed against canonical or non-canonical antigens, were equally discriminative of recovery and mortality COVID-19 outcomes. In both ML models, survivors were associated with increased virus-specific IgA and IgG3 antibodies and with higher antigen-specific antibody galactosylation. Intriguingly, pre-pandemic healthy controls had cross-reactive Abs directed against nsp13 which is a conserved protein in other alpha and beta coronaviruses. Notably, higher levels of nsp13-specific IgA antibodies were associated with recovery in severe COVID-19. In keeping with these findings, a model built on Ab profiles for endemic coronavirus antigens was also predictive of COVID-19 outcome bifurcation, with higher levels of IgA and IgG3 antibodies against OC43 S and NL63 S being associated with survival. Our results suggest the importance of Abs targeting non-canonical SARS-CoV-2 antigens as well as those directed against endemic coronaviruses in favorable outcomes of severe COVID-19.