Abstract Steroid-resistant asthma comprises an important source of morbidity in patient populations. TH17 cells represent a distinct population of CD4+ Th cells that mediate neutrophilic inflammation and are characterized by the production of IL-17, IL-22, and IL-6. To investigate the function of TH17 cells in the context of Ag-induced airway inflammation, we polarized naive CD4+ T cells from DO11.10 OVA-specific TCR-transgenic mice to a TH2 or TH17 phenotype by culturing in conditioned medium. In addition, we also tested the steroid responsiveness of TH2 and TH17 cells. In vitro, TH17 cytokine responses were not sensitive to dexamethasone (DEX) treatment despite immunocytochemistry confirming glucocorticoid receptor translocation to the nucleus following treatment. Transfer of TH2 cells to mice challenged with OVA protein resulted in lymphocyte and eosinophil emigration into the lung that was markedly reduced by DEX treatment, whereas TH17 transfer resulted in increased CXC chemokine secretion and neutrophil influx that was not attenuated by DEX. Transfer of TH17 or TH2 cells was sufficient to induce airway hyperresponsiveness (AHR) to methacholine. Interestingly, AHR was not attenuated by DEX in the TH17 group. These data demonstrate that polarized Ag-specific T cells result in specific lung pathologies. Both TH2 and TH17 cells are able to induce AHR, whereas TH17 cell-mediated airway inflammation and AHR are steroid resistant, indicating a potential role for TH17 cells in steroid-resistant asthma.

Interleukin-5 (IL-5), which is produced by CD4+ T helper 2 (Th2) cells, but not by Th1 cells, plays a key role in the development of eosinophilia in asthma. Despite increasing evidence that the outcome of many diseases is determined by the ratio of the two subsets of CD4+ T helper cells, Th1 and Th2, the molecular basis for Th1- and Th2-specific gene expression remains to be elucidated. We previously established a critical role for the transcription factor GATA-3 in IL-5 promoter activation in EL-4 cells, which express both Th1- and Th2-type cytokines. Our studies reported here demonstrate that GATA-3 is critical for expression of the IL-5 gene in bona fide Th2 cells. Whereas mutations in the GATA-3 site abolished antigen- or cAMP-stimulated IL-5 promoter activation in Th2 cells, ectopic expression of GATA-3 in Th1 cells or in a non-lymphoid, non-IL-5-producing cell line activated the IL-5 promoter. During the differentiation of naive CD4+ T cells isolated from T cell receptor transgenic mice, GATA-3 gene expression was up-regulated in developing Th2 cells, but was down-regulated in Th1 cells, and antigen- or cAMP-activated Th2 cells (but not Th1 cells) expressed the GATA-3 protein. Thus, GATA-3 may play an important role in the balance between Th1 and Th2 subsets in immune responses. Inhibition of GATA-3 activity has therapeutic potential in the treatment of asthma and other hypereosinophilic diseases. Interleukin-5 (IL-5), which is produced by CD4+ T helper 2 (Th2) cells, but not by Th1 cells, plays a key role in the development of eosinophilia in asthma. Despite increasing evidence that the outcome of many diseases is determined by the ratio of the two subsets of CD4+ T helper cells, Th1 and Th2, the molecular basis for Th1- and Th2-specific gene expression remains to be elucidated. We previously established a critical role for the transcription factor GATA-3 in IL-5 promoter activation in EL-4 cells, which express both Th1- and Th2-type cytokines. Our studies reported here demonstrate that GATA-3 is critical for expression of the IL-5 gene in bona fide Th2 cells. Whereas mutations in the GATA-3 site abolished antigen- or cAMP-stimulated IL-5 promoter activation in Th2 cells, ectopic expression of GATA-3 in Th1 cells or in a non-lymphoid, non-IL-5-producing cell line activated the IL-5 promoter. During the differentiation of naive CD4+ T cells isolated from T cell receptor transgenic mice, GATA-3 gene expression was up-regulated in developing Th2 cells, but was down-regulated in Th1 cells, and antigen- or cAMP-activated Th2 cells (but not Th1 cells) expressed the GATA-3 protein. Thus, GATA-3 may play an important role in the balance between Th1 and Th2 subsets in immune responses. Inhibition of GATA-3 activity has therapeutic potential in the treatment of asthma and other hypereosinophilic diseases. Activated CD4+ T cells are subdivided into two subsets, T helper 1 (Th1) and Th2, based on their biological functions, which, in turn, depend on the cytokines they produce (1Bottomly K. Immunol. Today. 1988; 9: 268-273Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (352) Google Scholar, 2Mossman T.R. Coffman R.L. Annu. Rev. Immunol. 1989; 7: 145-173Crossref PubMed Scopus (7139) Google Scholar, 3Janeway Jr., C.A. Bottomly K. Cell. 1994; 76: 275-285Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (783) Google Scholar, 4Abbas A.K. Murphy K.M. Sher A. Nature. 1996; 383: 787-793Crossref PubMed Scopus (3917) Google Scholar). Th1 cells produce interleukin-2 (IL-2) 1The abbreviations used are: IL, interleukin; IFN-γ, interferon-γ; Bt2cAMP, dibutyryl cyclic AMP; EMSAs, electrophoretic mobility shift assays; bp, base pair; kb, kilobase; TCR, T cell receptor; APCs, antigen-presenting cells; Ag, antigen; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; PMA, phorbol 12-myristate 13-acetate; Ab, antibody; TPA, 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate.and interferon-γ (IFN-γ) and stimulate microbicidal activity in macrophages and promote cell-mediated immunity (1Bottomly K. Immunol. Today. 1988; 9: 268-273Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (352) Google Scholar, 2Mossman T.R. Coffman R.L. Annu. Rev. Immunol. 1989; 7: 145-173Crossref PubMed Scopus (7139) Google Scholar, 3Janeway Jr., C.A. Bottomly K. Cell. 1994; 76: 275-285Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (783) Google Scholar, 4Abbas A.K. Murphy K.M. Sher A. Nature. 1996; 383: 787-793Crossref PubMed Scopus (3917) Google Scholar). Th2 cells, on the other hand, produce IL-4 and IL-5, which stimulate IgE production and eosinophilic inflammation, respectively (1Bottomly K. Immunol. Today. 1988; 9: 268-273Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (352) Google Scholar, 2Mossman T.R. Coffman R.L. Annu. Rev. Immunol. 1989; 7: 145-173Crossref PubMed Scopus (7139) Google Scholar, 3Janeway Jr., C.A. Bottomly K. Cell. 1994; 76: 275-285Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (783) Google Scholar, 4Abbas A.K. Murphy K.M. Sher A. Nature. 1996; 383: 787-793Crossref PubMed Scopus (3917) Google Scholar). There is good evidence that in atopic asthmatics, a Th2-type response occurs in the airways (5Walker C. Virchow J. Bruijnzeel P.L.B. Blaser K. J. Immunol. 1991; 1990: 1829-1835Google Scholar, 6Hamid Q. Azzawi M. Ying S. Moqbel R. Wardlaw A.J. Corrigan C.J. Bradley B. Durham S.R. Collins J.V. Jeffery P.K. Quint D.J. Kay A.B. J. Clin. Invest. 1991; 87: 1541-1546Crossref PubMed Scopus (747) Google Scholar, 7Robinson D.S. Hamid Q. Ying S. Tsicopoulos A. Barkans J. Bentley A.M. Corrigan C. Durham S.R. Kay A.B. N. Engl. J. Med. 1992; 326: 298-304Crossref PubMed Scopus (2601) Google Scholar, 8Krishnaswamy G. Liu M.C. Su S. Kumai M. Xiao H. Marsh D.G. Huang S. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1993; 9: 279-286Crossref PubMed Scopus (79) Google Scholar). Although it appears that the outcome of many diseases such as asthma is determined by the ratio of Th1 to Th2 cells (4Abbas A.K. Murphy K.M. Sher A. Nature. 1996; 383: 787-793Crossref PubMed Scopus (3917) Google Scholar), the molecular basis for Th1- and Th2-specific gene expression remains to be elucidated. Asthma is a chronic obstructive disease of the small airways. Evolving evidence indicates that asthma is the result of an inflammatory process interacting with a susceptible airway best defined at present as airway hyperresponsiveness (9Martin L.B. Kita H. Leiferman K.M. Gleich G.J. Int. Arch. Allergy Immunol. 1996; 109: 207-215Crossref PubMed Scopus (174) Google Scholar). In asthma, the most striking and consistent pathophysiology is damage to the bronchial epithelium caused by cytotoxic cationic proteins released by infiltrating eosinophils (10Frick W.E. Sedgwick J.B. Busse W.W. Am. Rev. Respir. Dis. 1989; 139: 1401-1406Crossref PubMed Scopus (108) Google Scholar,11Bousquet J. Chanez P. Lacoste J.Y. Barneon G. Ghavanian N. Enander I. Venge P. Ahlstedt S. Simony-Lafontaine J. Godard P. Michel F.B. N. Engl. J. Med. 1990; 323: 1033-1039Crossref PubMed Scopus (2267) Google Scholar). Various lines of evidence indicate that secreted products of activated T cells, such as the cytokine IL-5, play a central role in orchestrating the unique inflammatory response seen in asthma. Since it was isolated and cloned in the mid-1980s, the intimate relationship between IL-5, eosinophils, and asthma has been extensively documented (12Sanderson C.J. Blood. 1992; 79: 3101-3109Crossref PubMed Google Scholar). IL-5 has multiple effects on the biology of eosinophils not limited to differentiation, proliferation, recruitment, and activation (12Sanderson C.J. Blood. 1992; 79: 3101-3109Crossref PubMed Google Scholar). Increasing evidence places IL-5 in a key role in the development of eosinophilia in asthma (5Walker C. Virchow J. Bruijnzeel P.L.B. Blaser K. J. Immunol. 1991; 1990: 1829-1835Google Scholar, 6Hamid Q. Azzawi M. Ying S. Moqbel R. Wardlaw A.J. Corrigan C.J. Bradley B. Durham S.R. Collins J.V. Jeffery P.K. Quint D.J. Kay A.B. J. Clin. Invest. 1991; 87: 1541-1546Crossref PubMed Scopus (747) Google Scholar). IL-5 mRNA was significantly enhanced in bronchoalveolar lavage cells obtained from asthmatics challenged with ragweed antigen (8Krishnaswamy G. Liu M.C. Su S. Kumai M. Xiao H. Marsh D.G. Huang S. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1993; 9: 279-286Crossref PubMed Scopus (79) Google Scholar). Again, peripheral blood T cells from asthmatics were found to secrete IL-5 in response to the common house dust mite (Dermatophagoides farinae) antigen (13Kamei T. Ozaki T. Kawaji K. Banno K. Sano T. Azuma M. Ogura T. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1993; 9: 378-385Crossref PubMed Scopus (13) Google Scholar). Most striking, in ovalbumin-sensitized guinea pigs and mice, monoclonal antibody to IL-5 decreased pulmonary eosinophilia and prevented the development of airway hyperresponsiveness (14Gulbenkian A.R. Egan R.W. Fernandez X. Jones H. Kreutner W. Kung T. Payvandi F. Sullivan L. Zurcher J.A. Watnick A.S. Am. Rev. Respir. Dis. 1991; 146: 263-265Crossref Scopus (130) Google Scholar, 15Nakajima H. Iwamoto I. Tomoe S. Matsumura R. Tomioka H. Takatsu K. Yoshida S. Am. Rev. Respir. Dis. 1992; 146: 374-377Crossref PubMed Scopus (377) Google Scholar). Also, in a mouse model of asthma, IL-5-deficient mice were found to lack eosinophilia, lung pathology (16Foster P.S. Hogan S.P. Ramsay A.J. Matthaei K.I. Young I.G. J. Exp. Med. 1996; 183: 195-201Crossref PubMed Scopus (1288) Google Scholar, 17Kopf M. Brombacher F. Hodgkin P.D. Ramsay A.J. Milbourne E.A. Dai W.J. Ovington K.S. Behm C.A. Kohler G. Young I.G. Matthaei K.I. Immunity. 1996; 4: 15-24Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (545) Google Scholar), and airway hyperresponsiveness upon allergen challenge (16Foster P.S. Hogan S.P. Ramsay A.J. Matthaei K.I. Young I.G. J. Exp. Med. 1996; 183: 195-201Crossref PubMed Scopus (1288) Google Scholar). In both humans and mice, the production of IL-5 is restricted to a few cell types, which include T cells (7Robinson D.S. Hamid Q. Ying S. Tsicopoulos A. Barkans J. Bentley A.M. Corrigan C. Durham S.R. Kay A.B. N. Engl. J. Med. 1992; 326: 298-304Crossref PubMed Scopus (2601) Google Scholar), mast cells (18Plaut M. Pierce J.H. Watson C.J. Hanley-Hyde J. Nordan R.P. Paul W.E. Nature. 1989; 339: 64-67Crossref PubMed Scopus (1145) Google Scholar), and eosinophils (19Broide D.H. Paine M.M. Firestein G.S. J. Clin. Invest. 1992; 90: 1414-1424Crossref PubMed Scopus (332) Google Scholar), the predominant source being T cells of the Th2-type (7Robinson D.S. Hamid Q. Ying S. Tsicopoulos A. Barkans J. Bentley A.M. Corrigan C. Durham S.R. Kay A.B. N. Engl. J. Med. 1992; 326: 298-304Crossref PubMed Scopus (2601) Google Scholar). In general, IL-5 is not produced constitutively by Th2 cells. IL-5 gene expression has been shown to be stimulated by antigen, mitogens (concanavalin A), eicosanoid compounds (leukotriene B4 and prostaglandins), and cytokines (20Bohjanen P.R. Okajima M. Hodes R.J. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1990; 87: 5283-5287Crossref PubMed Scopus (91) Google Scholar, 21Lee H.J. Koyano-Nakagawa N. Naito Y. Nishida J. Arai N. Arai K. Yokota T. J. Immunol. 1993; 151: 6135-6142PubMed Google Scholar). Intracellular cAMP-increasing agents, such as IL-1α, prostaglandin E2, and the cAMP analogue dibutyryl cyclic AMP (Bt2cAMP), have been shown to differentially regulate cytokine production by Th1 and Th2 cells. Whereas the production of the Th1 response-inducing cytokine IL-12 and that of the Th1 cytokines IL-2 and IFN-γ are inhibited by cAMP-increasing agents, the production of IL-5 is strongly induced by the same agents, suggesting a possible immunoregulatory role for this second messenger (21Lee H.J. Koyano-Nakagawa N. Naito Y. Nishida J. Arai N. Arai K. Yokota T. J. Immunol. 1993; 151: 6135-6142PubMed Google Scholar, 22van der Pouw Kraan T.C.T.M. Boeije L.C.M. Smeenk R.J.T. Wijdenes J. Aarden L.A. J. Exp. Med. 1995; 181: 775-779Crossref PubMed Scopus (639) Google Scholar, 23Munoz E. Zubiaga A.M. Merrow M. Sauter N.P. Huber B.T. J. Exp. Med. 1990; 1990: 95-103Crossref Scopus (249) Google Scholar, 24Snijdewint F.G.M. Kalinski P. Wierenga E.A. Bos J.D. Kapsenberg M.L. J. Immunol. 1993; 150: 5321-5329PubMed Google Scholar). The molecular mechanisms underlying Th2 cell-specific IL-5 gene expression are unclear. In our previous studies of IL-5 promoter activation by cAMP in the murine cell line EL-4, which expresses both Th2- and Th1-type cytokines, we showed that deletion of the IL-5 promoter to −66, which disrupted a GATA site located between −70 and −60, abolished activation of the promoter (25Siegel M.D. Zhang D.-H. Ray P. Ray A. J. Biol. Chem. 1995; 270: 24548-24555Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (117) Google Scholar). Furthermore, in electrophoretic mobility shift assays (EMSAs), we demonstrated that the transcription factor GATA-3, but not GATA-4, binds to this GATA site (25Siegel M.D. Zhang D.-H. Ray P. Ray A. J. Biol. Chem. 1995; 270: 24548-24555Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (117) Google Scholar). This was the first description of the involvement of GATA-3 in the transcription of any cytokine gene (25Siegel M.D. Zhang D.-H. Ray P. Ray A. J. Biol. Chem. 1995; 270: 24548-24555Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (117) Google Scholar). Yamagata et al.(26Yamagata T. Nishida J. Sakai R. Tanaka T. Honda H. Hirano N. Mano H. Yazaki Y. Hirai H. Mol. Cell. Biol. 1995; 15: 3830-3839Crossref PubMed Scopus (80) Google Scholar), in their studies of transcription of the human IL-5 gene in the ATL-16T cell line, also demonstrated the importance of the GATA site in expression of the human IL-5 gene. However, two important points merit consideration in comparing these two studies. First, IL-5 gene expression in ATL-16T cells is largely constitutive (27Noma T. Nakakubo H. Sugita M. Kumagai S. Maeda M. Shimizu A. Honjo T. J. Exp. Med. 1989; 169: 1853-1858Crossref PubMed Scopus (69) Google Scholar). 2D.-H. Zhang and A. Ray, unpublished observations.However, in both humans and mice, the IL-5 gene is expressed in an inducible fashion, and therefore, the ATL-16T cells do not reflect the typical expression characteristics of the IL-5 gene either in humans or in mice. Second, GATA-4 is predominantly expressed in the heart, intestines, epithelium, and reproductive organs, and its expression is low or undetectable in both human and murine T cells (28Arceci R.J. King A.A.J. Simon M.C. Orkin S.H. Wilson D.B. Mol. Cell. Biol. 1993; 13: 2235-2246Crossref PubMed Google Scholar, 29Laverriere A.C. MacNeill C. Mueller C. Poelmann R.E. Burch J.B.E. Evans T. J. Biol. Chem. 1994; 269: 23177-23184Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Therefore, the atypical high level of GATA-4 activity in ATL-16T cells may contribute to the atypical (constitutive) nature of IL-5 gene expression in these cells. In another study, Prieschl et al.(30Prieschl E.E. Goouilleux-Gruart V. Walker C. Harrer N.E. Baumruker T. J. Immunol. 1995; 154: 6112-6119PubMed Google Scholar) showed that the GATA site located between −70 and −60 in the IL-5 promoter is also important for IL-5 gene expression in mast cells. In our previous study, we additionally demonstrated that activation of the IL-5 promoter also requires an intact AP-1 site within the CLE0 element (consensus lymphokineelement 0) located between −53 and −39 in the promoter; mutation of this site in the context of an ∼550-bp promoter totally abrogated promoter activity. In this report, we show that the transcription factor GATA-3 is crucial for IL-5 gene expression in bona fide Th2 cells and that ectopic expression of GATA-3 alone results in IL-5 promoter activation in a non-IL-5-producing cell line. We also show that GATA-3 activity is present only in Th2 cells and is undetectable in Th1 cells. Inhibition of GATA-3 activity may therefore be effective in the treatment of asthma and other hypereosinophilic diseases. Both D10 and C19 clones were maintained in Click's medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 5 units/ml murine recombinant IL-2 (Boehringer Mannheim), 50 μmβ-mercaptoethanol, 2 mml-glutamine, and 50 μg/ml gentamycin at 37 °C with 5% CO2 (31Kaye J. Porcelli S. Tite J. Jones B. Janeway J.C.A. J. Exp. Med. 1983; 158: 836-856Crossref PubMed Scopus (629) Google Scholar, 32Baron J.L. Madri J.A. Ruddle N.H. Hashim G. Janeway J.C.A. J. Exp. Med. 1993; 177: 57-68Crossref PubMed Scopus (793) Google Scholar). The cells were stimulated every 2 weeks with the specific antigen (conalbumin for D10 cells, used at 100 μg/ml) and peptide AC1–16 (ASQKRPSQRHGSKYL; derived from myelin basic protein, used at 5 μg/ml) and mitomycin C-treated splenocytes from syngeneic mice (I-Ak for D10 cells and I-Au for C19 cells). Prior to use in experiments, dead cells were removed by density gradient fractionation using lymphocyte separation medium (Organon Teknika). DO11.10 mice, which are transgenic for the TCR recognizing the ovalbumin peptide 323–339 (pOVA323–339), were provided on BALB/c background by Dr. Ken Murphy (Washington University, St. Louis, MO). To generate Th1 or Th2 cells from DO11.10 mice, naive CD4+ T cells were first isolated from the spleens by negative selection using monoclonal antibodies to CD8, class II MHC I-Ad, and anti-Ig-coated magnetic beads (Collaborative Research). Cultures were set up in flasks containing equal numbers of CD4+ T cells and T cell-depleted APCs at a concentration of 2 × 106 cells/ml. To generate Th1 cells, cultures contained pOVA323–339 at 5 μg/ml, IL-12 at 5 ng/ml, IL-2 at 10 units/ml, and anti-IL-4 at inhibitory concentrations. To generate Th2 cells, cultures contained pOVA323–339 at 5 μg/ml, IL-4 at 200 units/ml, IL-2 at 10 units/ml, and anti-IFN-γ antibody. Cells were maintained in culture for 3 days, and at the end of this period, cells were further stimulated with fresh mitomycin C-treated and T cell-depleted APCs and Ag for 8 or 24 h (for making nuclear extracts) or for 48 h for cytokine assays. Culture supernatants were assayed for the presence of cytokines by ELISA using kits from Endogen, Inc. (sensitivity: IL-4, 6 pg/ml; IL-5, 0.1 ng/ml; and IFN-γ, 2 ng/ml). Total cellular RNA was prepared by using Trizol (Life Technologies, Inc.) according to the instructions of the manufacturer. 10 μg of total RNA from each sample was fractionated on a formaldehyde-agarose gel and transferred to a nylon membrane. DNA fragments derived from murineGATA-3 cDNA (∼60-bp BglI-ClaI fragment not containing any part of the zinc finger domain) were labeled with [α-32P]dCTP using a random primer DNA labeling kit (Boehringer Mannheim). Hybridization was performed using QuikHyb (Stratagene) according to the instructions of the manufacturer. Rested D10 or A.E7 cells were washed once in serum-free RPMI 1640 medium and resuspended in the same medium. Cells (5 × 106) were incubated with 15 μg of DNA (5 μg of reporter plasmid, 2 μg of cytomegalovirus-β-galactosidase plasmid as a monitor for transfection efficiency, and carrier plasmid pGEM7Z to make up to 15 μg of total DNA) for 10 min at room temperature, and electroporation was carried out using a GenePulser (Bio-Rad) at 0.27 kV and 960 microfarads. The cells were left on ice for 10–30 min, diluted to 5 ml with fresh medium, and incubated at 37 °C with or without Bt2cAMP + PMA. For antigen stimulation, rested cells were first stimulated with conalbumin and mitomycin C-treated and T cell-depleted APCs in complete medium containing 5 units/ml IL-2 for 72 h and then subjected to electroporation. Cells were harvested for reporter gene assays as described previously (25Siegel M.D. Zhang D.-H. Ray P. Ray A. J. Biol. Chem. 1995; 270: 24548-24555Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (117) Google Scholar). HeLa cells were transfected as described previously (33Ray A. LaForge K.S. Sehgal P.B. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1991; 88: 7086-7090Crossref PubMed Scopus (34) Google Scholar, 34Ray A. Prefontaine K.E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 86: 752-756Crossref Scopus (937) Google Scholar). Cells were left unstimulated or were stimulated as described above. All APCs were mitomycin C-treated and depleted of T cells. Nuclear extracts were prepared as described previously (25Siegel M.D. Zhang D.-H. Ray P. Ray A. J. Biol. Chem. 1995; 270: 24548-24555Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (117) Google Scholar). The probes in the EMSAs were two double-stranded oligonucleotides containing sequences between −57 and −34 (containing the CLE0 element) and between −73 and −54 (containing the GATA element) in the IL-5 gene, and 22-bp oligonucleotides containing the consensus CREB element (from Stratagene). The oligonucleotides for the mutant CREB element were purchased from Santa Cruz Biotechnology. The sequences of the oligonucleotides used in the EMSAs were as follows:−73CCTCTATCTGATTGTTAGCA−54 (wild-type GATA), CCTCgcgaTGATTGTTAGCA (GATA mutant 1), CCTCTATCTGAaaccTAGCA (GATA mutant 2), CCTCTATCcttTTGTTAGCA (GATA mutant 3), and−57AGCAATTATTCATTTCCTCAGAGA−34 (CLE0). Complementary oligonucleotides were annealed before use in EMSAs. The antibodies to the c-Jun, JunB, JunD, and GATA-3 proteins were purchased from Santa Cruz Biotechnology. The anti-GATA-3 antibody was a mouse monoclonal IgG1 that does not cross-react with GATA-1, GATA-2, or GATA-4. The anti-Fos antibody was purchased from Oncogene Science Inc. The anti-GATA-4 antibody was kindly provided by Dr. David Wilson. The competitor oligonucleotides were added at a 100-fold molar excess. The binding reactions were analyzed by electrophoresis on 6% native polyacrylamide gels (acrylamide/bisacrylamide = 30:1). Electrophoresis was carried out at 200 V in 0.5 × TBE (1 × TBE = 0.05 m Tris base, 0.05 m boric acid, and 1.0 mm EDTA) at 4 °C. Gels were dried and subjected to autoradiography. We have used the established nontransformed murine T cell clones D10.G4.1 (Th2) (31Kaye J. Porcelli S. Tite J. Jones B. Janeway J.C.A. J. Exp. Med. 1983; 158: 836-856Crossref PubMed Scopus (629) Google Scholar) and C19 (Th1) (32Baron J.L. Madri J.A. Ruddle N.H. Hashim G. Janeway J.C.A. J. Exp. Med. 1993; 177: 57-68Crossref PubMed Scopus (793) Google Scholar) and Th1 and Th2 cells obtained by differentiation of naive CD4+ T cells from DO11.10 TCR transgenic mice to gain insight into mechanisms that permit IL-5 gene expression in Th2 cells but limit its expression in Th1 cells. In our previous studies of cAMP-induced IL-5 promoter activation using an ∼550-bp promoter fragment and the murine T cell line EL-4, we had identified two regions in the IL-5 5′-flanking region that were critical for induction of the IL-5 promoter: one was the AP-1-binding site within the CLE0 element, whereas the other was a region between −70 and −60 containing two overlapping GATA sites, deletion of which abrogated activation of the promoter (25Siegel M.D. Zhang D.-H. Ray P. Ray A. J. Biol. Chem. 1995; 270: 24548-24555Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (117) Google Scholar). To elucidate the molecular mechanisms underlying transcriptional activation of the IL-5 gene by Ag in Th2 cells, we transfected the murine Th2 clone D10.G4.1 (31Kaye J. Porcelli S. Tite J. Jones B. Janeway J.C.A. J. Exp. Med. 1983; 158: 836-856Crossref PubMed Scopus (629) Google Scholar) with a reporter gene (firefly luciferase) construct containing a 1.7-kb promoter fragment from the 5′-flanking region immediately upstream of the transcriptional start site of the IL-5 gene. Both Ag and Bt2cAMP + PMA caused a 10–20-fold activation of the wild-type IL-5 promoter, and mutations in the AP-1 site or the GATA site in the context of the 1.7-kb promoter completely abolished activation of the IL-5 promoter (Fig. 1 A). Mutations in the NF-AT site, on the other hand, had no effect on IL-5 promoter activity. We next investigated the binding of nuclear proteins to the GATA element and the CLE0 element using nuclear extracts from Th2 (D10) cells. As shown in Fig. 2 A (lane 1), two complexes were detected using nuclear extracts from unstimulated D10 cells. The binding intensity of both complexes was augmented upon stimulation of the cells with Bt2cAMP + PMA (lane 2). Although both complexes were competed for by an excess of the unlabeled wild-type oligonucleotide, competition for complex I formation was incomplete even with a 100-fold molar excess of the unlabeled competitor, suggesting that complex I binds with a lower affinity to the GATA site than complex II (lane 3). Oligonucleotides containing specific mutations in three different regions of the double GATA site were also used as competitors. Mutant 1 contained mutations in the distal GATA sequence, and mutant 2 in the proximal sequence, whereas mutant 3 was mutated in both sequences. None of these mutants was able to compete for formation of the complexes, suggesting the involvement of the entire sequence between −70 and −60 in the formation of the complexes (lanes 4–6). The complexes (especially complex II) were supershifted by an anti-GATA-3 antibody (Ab) (lane 7), but not by an anti-GATA-4 antiserum (lane 9). To compare GATA-3 DNA binding activity between Th1 and Th2 cells, we performed a similar analysis with nuclear extracts from both D10 and C19 (Th1) cells prepared in the same experiment under identical conditions. As shown in Fig. 2 B (lower panel), nuclear proteins from induced D10 cells generated two complexes that were supershifted by the anti-GATA-3 Ab (lane 3), but not by the anti-GATA-4 Ab (lane 4). Using identical protein amounts of nuclear extracts prepared from C19 cells, we detected a very low level of binding activity in resting cells (Fig. 2 B, upper panel, lane 1). Upon treatment of the C19 cells with Bt2cAMP and PMA, whether alone (data not shown) or in combination, the intensity of the complexes did not increase, but consistently diminished (Fig. 2 B, upper panel, compare lane 2 withlane 1). We then tested the same extracts for binding to the AP-1 site within the CLE0 element. As shown in Fig. 2 B, used at only half the amounts used in the GATA-3 binding assays, robust inducible binding activity was detected with both D10 and C19 nuclear extracts. The anti-c-Jun and anti-c-Fos (reactive to all Fos family proteins) Abs did not affect the formation of the complex with either extract (lanes 7 and 10, respectively), whereas the anti-JunB and anti-JunD Abs supershifted/inhibited complex formation (lanes 8 and 9, respectively). Taken together, these results demonstrated that D10 and C19 cells contain similar levels of AP-1 binding activity. However, D10 cells constitutively contain some GATA-3 DNA binding activity that is augmented upon stimulation of the cells. In contrast, unstimulated C19 cells contain very little GATA-3 DNA binding activity that decreases upon stimulation of the cells. We investigated whether the observed difference in GATA-3 binding activity between the Th1 (C19) and Th2 (D10) clones was also true in Th1 and Th2 cells obtained by differentiation of naive splenic CD4+ T cells from DO11.10 TCR transgenic mice. Nuclear extracts were prepared from the Th1 and Th2 cells stimulated with Ag for 8 or 24 h, and GATA and AP-1 binding activities were determined with the extracts. The Th1 cell extract from both time points generated two complexes with the GATA probe (Fig. 3 A, lanes 1–6), whereas the Th2 extract generated three complexes (lanes 7–12). Complexes I and II were of the same mobility and reactivity to antisera as complexes I and II illustrated in Fig. 2. Complex II was not formed with the Th1 extract. A new complex (III), specific for Ag stimulation and of mobility intermediate between complexes I and II, was formed with both Th1 and Th2 extracts. Complex III was more distinct with the 24-h extracts (Fig. 3 A,left panel, compare lane 4 with lane 1 and lane 10 with lane 7). Complex III, formed with both the Th1 extracts (lanes 3 and 6) and the Th2 extracts (lanes 9 and 12), was inhibited by the anti-GATA-4 antiserum. However, the anti-GATA-3 Ab did not react with any of the complexes formed with the Th1 extracts (lanes 2and 5). By contrast, in our EMSAs with the Th2 extracts, complex I was slightly inhibited by the anti-GATA-3 Ab, and complex II, only formed with Th2 nuclear proteins, was supershifted by the anti-GATA-3 Ab (lanes 8 and 11). Essentially identical data were obtained in EMSAs with nuclear extracts from Ag-stimulated D10 and C19 cells (data not shown). We have also explored GATA-3 binding activity in another Th1-type clone, A.E7 (35Beverly B. Kang S.M. Lenardo M.J. Schwartz R.H. Int. Immunol. 1992; 4: 661-671Crossref PubMed Scopus (336) Google Scholar). No IL-5 mRNA was detected in Northern blot analyses of RNA prepared from A.E7 cells that were stimulated for 24 h with Ag (data not shown). Also, nuclear extracts prepared from Ag-induced A.E7 cells had no detectable GATA-3 binding activity (data not shown). We do not know the exact composition of the different complexes that are formed with Th2 nuclear extracts and the IL-5 GATA site. Complex II could represent a higher order form (dimer or tetramer) of complex I that may contain a monomer or dimer of GATA-3. The oligonucleotide competition experiments suggest that complex I binds to the GATA site with a lower affinity than complex II. Also, formation of complex II was consistently more sensitive to the anti-GATA-3 antibody than formation of complex I, suggesting that the epitope recognized by the anti-GATA-3 monoclonal antibody in the GATA-3 protein is more accessible in complex II. Taken together, it appears that activated Th1 cells lack GATA-3 DNA binding activity. The significance of the reactivity of complex III to the anti-GATA-4 antiserum is unclear at the present time since the expression of GATA-4 has only been described in the heart, intestines, and gonads (28Arceci R.J. King A.A.J. Simon M.C. Orkin S.H. Wilson D.B. Mol. Cell. Biol. 1993; 13: 2235-2246Crossref PubMed Google Scholar, 29Laverriere A.C. MacNeill C. Mueller C. Poelmann R.E. Burch J.B.E. Evans T. J. Biol. Chem. 1994; 269: 23177-2318

The aberrant overexpression of interleukin 6 (IL-6) is implicated as an autocrine mechanism in the enhanced proliferation of the neoplastic cell elements in various B- and T-cell malignancies and in some carcinomas and sarcomas; many of these neoplasms have been shown to be associated with a mutated p53 gene. The possibility that wild-type (wt) p53, a nuclear tumor-suppressor protein, but not its transforming mutants might serve to repress IL-6 gene expression was investigated in HeLa cells. We transiently cotransfected these cells with constitutive cytomegalovirus (CMV) enhancer/promoter expression plasmids overproducing wt or mutant human or murine p53 and with appropriate chloramphenicol acetyltransferase (CAT) reporter plasmids containing the promoter elements of human IL-6, c-fos, or beta-actin genes or of porcine major histocompatibility complex (MHC) class I gene in pN-38 to evaluate the effect of the various p53 species on these promoters. Murine and human wt p53 derived from pCMVNc9 and pC53-SN3, respectively, strongly repressed the IL-6 (promoter position -225 to +13), c-fos (-711 to +42), beta-actin (-3400 to +912), and MHC (-528 to -38) promoters in serum-induced HeLa cells; additionally, IL-6 promoter/CAT transcription unit constructs induced by IL-1, phorbol ester, or pseudorabies virus were also repressed by wt human and murine p53. The murine transforming mutant p53 (pCMVc5) was less active in repressing the IL-6, c-fos, beta-actin, and MHC promoter constructs. The human p53 mutant derived from pC53-SCX3 was also less active than the wt protein in repressing the IL-6, c-fos, beta-actin, and MHC promoters, except that serum-induced IL-6/CAT expression was equally repressed by both human wt and mutant p53. In similar transient transfection experiments in HeLa cells, overexpression of the wt human retinoblastoma susceptibility gene product, RB, was found to repress the serum-induced IL-6 (-225 to +13), c-fos (-711 to +42), and beta-actin (-3400 to +912) promoters but not the PRV-induced IL-6 (-110 to +13) or the serum-induced MHC (-528 to -38) promoters. These observations identify transcriptional repression as a property of p53 and suggest that p53 and RB may be involved as transcriptional repressors in modulating IL-6 gene expression during cellular differentiation and oncogenesis.

Severe asthma (SA) is a challenge to control, as patients are not responsive to high doses of systemic corticosteroids (CS). In contrast, mild-moderate asthma (MMA) is responsive to low doses of inhaled CS, indicating that Th2 cells, which are dominant in MMA, do not solely orchestrate SA development. Here, we analyzed broncholalveolar lavage cells isolated from MMA and SA patients and determined that IFN-γ (Th1) immune responses are exacerbated in the airways of individuals with SA, with reduced Th2 and IL-17 responses. We developed a protocol that recapitulates the complex immune response of human SA, including the poor response to CS, in a murine model. Compared with WT animals, Ifng-/- mice subjected to this SA model failed to mount airway hyperresponsiveness (AHR) without appreciable effect on airway inflammation. Conversely, AHR was not reduced in Il17ra-/- mice, although airway inflammation was lower. Computer-assisted pathway analysis tools linked IFN-γ to secretory leukocyte protease inhibitor (SLPI), which is expressed by airway epithelial cells, and IFN-γ inversely correlated with SLPI expression in SA patients and the mouse model. In mice subjected to our SA model, forced SLPI expression decreased AHR in the absence of CS, and it was further reduced when SLPI was combined with CS. Our study identifies a distinct immune response in SA characterized by a dysregulated IFN-γ/SLPI axis that affects lung function.

Abstract Coronavirus disease 2019 (COVID-19) caused by SARS-CoV-2 infection presents with varied clinical manifestations 1 , ranging from mild symptoms to acute respiratory distress syndrome (ARDS) with high mortality 2,3 . Despite extensive analyses, there remains an urgent need to delineate immune cell states that contribute to mortality in severe COVID-19. We performed high-dimensional cellular and molecular profiling of blood and respiratory samples from critically ill COVID-19 patients to define immune cell genomic states that are predictive of outcome in severe COVID-19 disease. Critically ill patients admitted to the intensive care unit (ICU) manifested increased frequencies of inflammatory monocytes and plasmablasts that were also associated with ARDS not due to COVID-19. Single-cell RNAseq (scRNAseq)-based deconvolution of genomic states of peripheral immune cells revealed distinct gene modules that were associated with COVID-19 outcome. Notably, monocytes exhibited bifurcated genomic states, with expression of a cytokine gene module exemplified by CCL4 (MIP-1β) associated with survival and an interferon signaling module associated with death. These gene modules were correlated with higher levels of MIP-1β and CXCL10 levels in plasma, respectively. Monocytes expressing genes reflective of these divergent modules were also detectable in endotracheal aspirates. Machine learning algorithms identified the distinctive monocyte modules as part of a multivariate peripheral immune system state that was predictive of COVID-19 mortality. Follow-up analysis of the monocyte modules on ICU day 5 was consistent with bifurcated states that correlated with distinct inflammatory cytokines. Our data suggests a pivotal role for monocytes and their specific inflammatory genomic states in contributing to mortality in life-threatening COVID-19 disease and may facilitate discovery of new diagnostics and therapeutics.

Abstract Background The horse plays crucial roles across the globe, including in horseracing, as a working and companion animal and as a food animal. The horse hindgut microbiome makes a key contribution in turning a high fiber diet into body mass and horsepower. However, despite its importance, the horse hindgut microbiome remains largely undefined. Here, we applied culture-independent shotgun metagenomics to thoroughbred equine faecal samples to deliver novel insights into this complex microbial community. Results We performed metagenomic sequencing on five equine faecal samples to construct 123 high- or medium-quality metagenome-assembled genomes from Bacteria and Archaea. In addition, we recovered nearly 200 bacteriophage genomes. We document surprising taxonomic and functional diversity, encompassing dozens of novel or unnamed bacterial genera and species, to which we have assigned new Candidatus names. Many of these genera are conserved across a range of mammalian gut microbiomes. Conclusions Our metagenomic analyses provide new insights into the bacterial, archaeal and bacteriophage components of the horse gut microbiome. The resulting datasets provide a key resource for future high-resolution taxonomic and functional studies on the equine gut microbiome.

Abstract Respiratory infection by Pseudomonas aeruginosa , common in hospitalized immunocompromised and immunocompetent ventilated patients, can be life-threatening because of antibiotic resistance. This raises the question of whether the host’s immune system can be educated to combat this bacterium. Here we show that prior exposure to a single low dose of lipopolysaccharide (LPS) protects mice from a lethal infection by P. aeruginosa . LPS exposure trained the innate immune system by promoting expansion of neutrophil and interstitial macrophage populations distinguishable from other immune cells with enrichment of gene sets for phagocytosis- and cell-killing-associated genes. The cell-killing gene set in the neutrophil population uniquely expressed Lgals3 , which encodes the multifunctional antibacterial protein, galectin-3. Intravital imaging for bacterial phagocytosis, assessment of bacterial killing and neutrophil-associated galectin-3 protein levels together with use of galectin-3-deficient mice collectively highlight neutrophils and galectin-3 as central players in LPS-mediated protection. Patients with acute respiratory failure revealed significantly higher galectin-3 levels in endotracheal aspirates (ETAs) of survivors compared to non-survivors, galectin-3 levels strongly correlating with a neutrophil signature in the ETAs and a prognostically favorable hypoinflammatory plasma biomarker subphenotype. Taken together, our study provides impetus for harnessing the potential of galectin-3-expressing neutrophils to protect from lethal infections and respiratory failure.

Abstract Chickens and guinea fowl are commonly reared in Gambian homes as affordable sources of protein. Using standard microbiological techniques, we obtained 68 caecal isolates of Escherichia coli from ten chickens and nine guinea fowl in rural Gambia. After Illumina whole-genome sequencing, 28 sequence types were detected in the isolates (four of them novel), of which ST155 was the most common (22/68, 32%). These strains span four of the eight main phylogroups of E. coli , with phylogroups B1 and A being most prevalent. Nearly a third of the isolates harboured at least one antimicrobial resistance gene, while most of the ST155 isolates (14/22, 64%) encoded resistance to ≥3 classes of clinically relevant antibiotics, as well as putative virulence factors, suggesting pathogenic potential in humans. Furthermore, hierarchical clustering revealed that several Gambian poultry strains were closely related to isolates from humans. Although the ST155 lineage is common in poultry from Africa and South America, the Gambian ST155 isolates belong to a unique cgMLST cluster comprised of closely related (38-39 alleles differences) isolates from poultry and livestock from sub-Saharan Africa—suggesting that strains can be exchanged between poultry and livestock in this setting. Continued surveillance of E. coli and other potential pathogens in rural backyard poultry from sub-Saharan Africa is warranted. Author notes All supporting data and protocols have been provided within the article or as supplementary data files. Eleven supplementary figures and eight supplementary files are available with the online version of this article. Data summary The genomic assemblies for the isolates reported here are available for download from EnteroBase ( http://enterobase.warwick.ac.uk/species/index/ecoli ) and the EnteroBase assembly barcodes are provided in File S2. Sequences have been deposited in the NCBI SRA, under the BioProject ID: PRJNA616250 and accession numbers SAMN14485281 to SAMN14485348 (File S2). Assemblies have been deposited in GenBank under the BioProject ID: PRJNA616250 and accession numbers CP053258 and CP053259 . Impact statement Domestic birds play a crucial role in human society, in particular contributing to food security in low-income countries. Many households in Sub-Saharan Africa rear free-range chickens and guinea fowl, which are often left to scavenge for feed in and around the family compound, where they are frequently exposed to humans, other animals and the environment. Such proximity between backyard poultry and humans is likely to facilitate transmission of pathogens such as Escherichia coli or antimicrobial resistance between the two host species. Little is known about the population structure of E. coli in rural chickens and guinea fowl, although this information is needed to contextualise the potential risks of transmission of bacterial strains between humans and rural backyard poultry. Thus, we sought to investigate the genomic diversity of E. coli in backyard poultry from rural Gambia.

Background: For long-stay patients on the adult intensive care unit, the gut microbiota plays a key role in determining the balance between health and disease. However, it remains unclear which ICU patients might benefit from interventions targeting the gut microbiota or the pathogens therein. Methods: We undertook a prospective observational study of twenty-four ICU patients, in which serial faecal samples were subjected to shotgun metagenomic sequencing, phylogenetic profiling and microbial genome analyses. Results: Two-thirds of patients experienced a marked drop in gut microbial diversity (to an inverse Simpson's index of <4) at some stage during their stay in ICU, often accompanied by absence or loss of beneficial commensal bacteria. Intravenous administration of the broad-spectrum antimicrobial agent meropenem was significantly associated with loss of gut microbial diversity, but administration of other antibiotics, including piperacillin-tazobactam, failed to trigger statistically detectable changes in microbial diversity. In three quarters of ICU patients, we documented episodes of gut domination by pathogenic strains, with evidence of cryptic nosocomial transmission of Enterococcus faecium. In some patients we also saw domination of the gut microbiota by commensal organisms, such as Methanobrevibacter smithii. Conclusions: Our results support a role for metagenomic surveillance of the gut microbiota and pave the way for patient-specific interventions that maintain or restore gut microbial diversity in the ICU.