DS
David Shore
Author with expertise in Ribosome Structure and Translation Mechanisms
Achievements
Cited Author
Open Access Advocate
Key Stats
Upvotes received:
0
Publications:
20
(50% Open Access)
Cited by:
3,837
h-index:
61
/
i10-index:
102
Reputation
Biology
< 1%
Chemistry
< 1%
Economics
< 1%
Show more
How is this calculated?
Publications
0

Purification and cloning of a DNA binding protein from yeast that binds to both silencer and activator elements

David Shore et al.Dec 1, 1987
K
D
A DNA binding protein (RAP1, previously called SBF-E) has been shown to bind to putative regulatory sites at both yeast mating-type silencers, yet is not the product of genetically identified regulators of the silent loci. Here, we report the purification of RAP1 by DNA affinity chromatography, and the isolation of its gene from a λgt11 genomic library using antibodies raised against the protein. Disruption of the chromosomal copy of this gene is lethal. We show that RAP1 protein also binds in vitro to the upstream activation site (UAS) of MATα and ribosomal protein genes. In addition, we show that two different UAS-associated RAP1 binding sites can substitute in vivo for a silencer binding site. Our results suggest that RAP1 may be a transcriptional regulator that can play a role in either repression or activation of transcription, depending upon the context of its binding site.
0
Citation632
0
Save
0

Evidence that a complex of SIR proteins interacts with the silencer and telomere-binding protein RAP1.

Paolo Moretti et al.Oct 1, 1994
D
L
K
P
The maintenance of transcriptional silencing at HM mating-type loci and telomeres in yeast requires the SIR2, SIR3, and SIR4 proteins, none of which appear to be DNA-binding proteins. Here we show that SIR3 and SIR4 interact with a carboxy-terminal domain of the silencer, telomere, and UAS-binding protein RAP1. We identified SIR3 and SIR4 in a two-hybrid screen for RAP1-interacting factors and showed that SIR3 interacts both with itself and with SIR4. The interaction between RAP1 and SIR3 can be observed in vitro in the absence of other yeast proteins. Consistent with the notion that native SIR proteins interact with the RAP1 carboxyl terminus, we show that mutation of the endogenous SIR3 and SIR4 genes increases transcriptional activation by LexA/RAP1 hybrids. To test the importance of the RAP1-SIR3 interaction for silencing, we identified mutations in the RAP1 carboxyl terminus that either diminish or abolish this interaction. When introduced into the native RAP1 protein, these mutations cause corresponding defects in silencing at both HMR and telomeres. We propose that RAP1 acts in the initiation of transcriptional silencing by recruiting a complex of SIR proteins to the chromosome via protein-protein interactions. These data are consistent with a model in which SIR3 and SIR4 play a structural role in the maintenance of silent chromatin and indicate that their action is initiated at the silencer itself.
0
Citation543
0
Save
0

A Protein-Counting Mechanism for Telomere Length Regulation in Yeast

Stéphane Marcand et al.Feb 14, 1997
D
É
S
In the yeast Saccharomyces cerevisiae , telomere elongation is negatively regulated by the telomere repeat-binding protein Rap1p, such that a narrow length distribution of telomere repeat tracts is observed. This length regulation was shown to function independently of the orientation of the telomere repeats. The number of repeats at an individual telomere was reduced when hybrid proteins containing the Rap1p carboxyl terminus were targeted there by a heterologous DNA-binding domain. The extent of this telomere tract shortening was proportional to the number of targeted molecules, consistent with a feedback mechanism of telomere length regulation that can discriminate the precise number of Rap1p molecules bound to the chromosome end.
0
Citation511
0
Save
0

A RAP1-interacting protein involved in transcriptional silencing and telomere length regulation.

C Hardy et al.May 1, 1992
D
L
C
The yeast RAP1 protein is a sequence-specific DNA-binding protein that functions as both a repressor and an activator of transcription. RAP1 is also involved in the regulation of telomere structure, where its binding sites are found within the terminal poly(C1-3A) sequences. Previous studies have indicated that the regulatory function of RAP1 is determined by the context of its binding site and, presumably, its interactions with other factors. Using the two-hybrid system, a genetic screen for the identification of protein-protein interactions, we have isolated a gene encoding a RAP1-interacting factor (RIF1). Strains carrying gene disruptions of RIF1 grow normally but are defective in transcriptional silencing and telomere length regulation, two phenotypes strikingly similar to those of silencing-defective rap1s mutants. Furthermore, hybrid proteins containing rap1s missense mutations are defective in an interaction with RIF1 in the two-hybrid system. Taken together, these data support the idea that the rap1s phenotypes are attributable to a failure to recruit RIF1 to silencers and telomeres and suggest that RIF1 is a cofactor or mediator for RAP1 in the establishment of a repressed chromatin state at these loci. By use of the two-hybrid system, we have isolated a mutation in RIF1 that partially restores the interaction with rap1s mutant proteins.
0
Citation484
0
Save
0

DNA flexibility studied by covalent closure of short fragments into circles.

David Shore et al.Aug 1, 1981
R
J
D
The ring closure probability, or j factor, has been measured for DNA restriction fragments of defined sequence bearing EcoRI cohesive ends and ranging in size from 126 to 4361 base pairs (bp). The j factor is defined as the ratio of the equilibrium constants for cyclization and for bimolecular association via the cohesive ends. The end-joining reactions are fast compared to covalent closure of the cohesive ends by T4 DNA ligase. The rate of ligase closure is shown to be proportional to the equilibrium fraction of DNA molecules with joined cohesive ends, both in cyclization and in bimolecular association reactions. The j factor changes by less than 10-fold between 242 and 4361 bp, whereas it decreases by more than 100-fold between 242 and 126 bp as the DNA reaches the size range of the persistence length (150 bp). As regards ring closure, short DNA fragments are surprisingly flexible. These data are in good agreement with predictions by others for the ring closure probability of a wormlike chain.
0
Paper
Citation454
0
Save
0

Energetics of DNA twisting

David Shore et al.Nov 1, 1983
R
D
The twisting potential of DNA has been determined directly by a method that measures the cyclization probability or j-factor of EcoRI restriction fragments as a function of DNA twist. The cyclization probability is proportional to Kc, the equilibrium constant for cyclization of the restriction fragment via its cohesive ends (Shore et al., 1981). Here we vary the twist of the DNA by making small internal additions to or deletions from a 242 bp EcoRI restriction fragment. A series of 12 DNA molecules has been studied, which range in length from 237 to 254 bp. The cyclization probability is measured from the rates of covalent closure by phage T4 DNA ligase of two systems: (1) a linear restriction fragment in equilibrium with its cyclized form and (2) half molecules (cut by a blunt-end endonuclease) in equilibrium with joined half molecules. The striking result is that, in this DNA size range, the j-factor depends strongly on the fractional twist: the difference between the total helical twist and the nearest integer. Thus j depends in an oscillatory manner on DNA length between 237 and 254 bp with a period of about 10 bp. These data give the free energy of DNA twisting as a function of twist. The curve of j versus DNA length can be fitted to a harmonic twisting potential with a torsional constant of C = 2·4 × 10−19 erg cm. This value is in reasonable agreement with different estimates of C made by Barkley & Zimm (1979: C = 1·8 × 10−19 to 4·1 × 10−19 erg cm) and is somewhat larger than the value obtained resulting from the kinetics of DNA twisting measured by fluorescence depolarization of ethidium intercalated into DNA (C = 1·4 × 10−19 erg cm; Millar et al., 1982; Thomas et al., 1980) or from spin label studies (Hurley et al., 1982). Our experiments provide a direct measurement of the torsional free energy and they show that the DNA twisting potential is symmetric. Our experiments also indicate that the DNA helix is continuous, or nearly so, in a nicked circle; presumably this happens because the DNA stacking interaction maintains the double helix in register across a single-strand nick. As a consequence, the twist of a singly nicked DNA circle is integral for small (≊250 bp) planar DNA circles and there is a change in twist upon cyclization. This conclusion is supported by finding that the rate of closure by T4 ligase of singly nicked circles is not dependent on either small or large changes in DNA length, in contrast to the results given above for cyclization of linear restriction fragments. The temperature dependence of the ligase closure reaction has also been measured for three systems: (1) linear restriction fragments in equilibrium with cyclized molecules; (2) singly nicked circles; and (3) half molecules in equilibrium with joined half molecules. The temperature dependence data confirm that systems (1) and (3) are in equilibrium as measured by the rate of the ligase closure reaction: the rates of these two reactions increase strongly with decreasing temperature, in response to the increasing fraction of joined cohesive ends at low temperatures, whereas the rate of closing singly nicked circles increases with increasing temperature, as expected for a typical enzyme-catalyzed reaction. The ratio of rate constants measured for (1) and (2) gives Kc, the equilibrium constant for cyclization. Values obtained in this way show reasonable agreement with electron microscopic measurement of Kc by Mertz & Davis (1972). The ratio of rate constants measured for (3) and (2) gives Ka, the equilibrium constant for bimolecular association of half molecules, and the temperature dependence of Ka gives a reasonable value (−32(±10) kcal/mol) for the enthalpy of joining the EcoRI cohesive ends.
0

A novel Rap1p-interacting factor, Rif2p, cooperates with Rif1p to regulate telomere length in Saccharomyces cerevisiae.

David Wotton et al.Mar 15, 1997
D
D
The Saccharomyces cerevisiae Rap1 protein binds with high affinity to sites within the poly(C(1-3)A) tracts at telomeres, where it plays a role in both telomere length regulation and the initiation of telomeric silencing. Rap1p initiates silencing at telomeres by interacting through its carboxy-terminal domain with Sir3p and Sir4p, both of which are required for repression. This same domain of Rap1p also negatively regulates telomere elongation, through an unknown mechanism. We have identified a new Rap1-interacting factor (Rif2p) that plays a role in telomere length regulation. Rif2p has considerable functional similarities with a Rap1p-interacting factor (Rif1p) identified previously. Mutations in RIF1 or RIF2 (unlike mutations in the silencing genes SIR3 and SIR4) result in moderate telomere elongation and improved telomeric silencing. However, deletion of both RIF1 and RIF2 in the same cell results in a dramatic increase in telomere length, similar to that seen with a carboxy-terminal truncation of Rap1p. In addition, overexpression of either RIF1 or RIF2 decreases telomere length, and co-overexpression of these proteins can reverse the telomere elongation effect of overexpression of the Rap1p carboxyl terminus. Finally, we show that Rif1p and Rif2p can interact with each other in vivo. These results suggest that telomere length regulation is mediated by a protein complex consisting of Rif1p and Rif2p, each of which has distinct regulatory functions. One role of Rap1p in telomere length regulation is to recruit these proteins to the telomeres.
0
Citation405
0
Save
0

Chromosomal landscape of nucleosome-dependent gene expression and silencing in yeast

John Wyrick et al.Nov 1, 1999
+5
E
F
J
0
Citation387
0
Save
2

Not1 and Not4 inversely determine mRNA solubility that sets the dynamics of co-translational events

George Allen et al.Mar 14, 2022
+13
O
B
G
Abstract Background The Ccr4-Not complex is most well known as the major eukaryotic deadenylase. However, several studies have uncovered roles of the complex, in particular of the Not subunits, unrelated to deadenylation and relevant for translation. In particular, the existence of Not condensates that regulate translation elongation dynamics have been reported. Typical studies that evaluate translation efficiency rely on soluble extracts obtained after disruption of cells and ribosome profiling. Yet cellular mRNAs in condensates can be actively translated and may not be present in such extracts. Results In this work, by analyzing soluble and insoluble mRNA decay intermediates in yeast, we determine that insoluble mRNAs are enriched for ribosomes dwelling at non-optimal codons compared to soluble mRNAs. mRNA decay is higher for soluble RNAs, but the proportion of co-translational degradation relative to the overall mRNA decay is higher for insoluble mRNAs. We show that depletion of Not1 and Not4 inversely impact mRNA solubilities and, for soluble mRNAs, ribosome dwelling according to codon optimality. Depletion of Not4 solubilizes mRNAs with lower non-optimal codon content and higher expression that are rendered insoluble by Not1 depletion. By contrast, depletion of Not1 solubilizes mitochondrial mRNAs, which are rendered insoluble upon Not4 depletion. Conclusion Our results reveal that mRNA solubility defines dynamics of co-translation events and is oppositely regulated by Not1 and Not4, a mechanism that we additionally determine may already be set by Not1 promoter association in the nucleus.
2
Citation5
0
Save
2

ChEC-seq: a robust method to identify protein-DNA interactions genome-wide

Maria Bruzzone et al.Feb 18, 2021
+4
L
B
M
Abstract Mittal et al. (2021; first brought to our attention in May 2019) have raised concerns regarding the Chromatin Endogenous Cleavage-sequencing (ChEC-seq) technique (Zentner et al., 2015) that may create a false impression that this method has fundamental flaws which prevent one from distinguishing between signal and noise. Although Mittal et al. focus on studies of the global co-activators SAGA, TFIID and Mediator that we were not involved in, we feel obliged to highlight here several of our own publications (Albert et al., 2019; Bruzzone et al., 2018; Hafner et al., 2018; Kubik et al., 2019; Kubik et al., 2018), as well as recent unpublished data, that employed ChEC-seq and directly addressed the observation raised by Mittal et al. that cleavage maps for various MNase fusion proteins often qualitatively resemble each other and those generated by “free” (unfused) MNase. Our studies lay out a clear path for determining sites of preferential factor localization by normalization of ChEC-seq experimental data to matched free-MNase controls. They also demonstrate the use of in vivo functional assays to assess ChEC-seq reliability and reveal examples where ChEC-seq identifies functional binding sites missed by conventional ChIP-seq analysis.
Load More