Abstract Years of time-series gene expression studies have built a strong understanding of clock-controlled pathways across species. However, comparatively little is known about how ‘non-clock’ pathways influence clock function. We developed a new computational approach to explore candidate pathways coupled to the clock in human tissues. This method, termed LTM, is an in silico screen to infer genetic influences on circadian clock function. LTM uses natural variation in gene expression in human data and directly links gene expression variation to clock strength independent of longitudinal data. We applied LTM to three human skin and one melanoma datasets and found that the cell cycle is the top candidate clock-coupled pathway in healthy skin. In addition, we applied LTM to thousands of tumor samples from 11 cancer types in the TCGA database and found that extracellular matrix organization-related pathways are tightly associated with the clock strength in humans. Further analysis shows that clock strength in tumor samples are correlated with the proportion of cancer-associated fibroblasts and endothelial cells. Therefore, we show both the power of LTM in predicting clock-coupled pathways and classify factors associated with clock strength in human tissues. LTM is available on GitHub to facilitate its use.

Abstract Genetics impacts sleep, yet, the molecular mechanisms underlying sleep regulation remain elusive. We built machine learning (ML) models to predict genes based on their similarity to known sleep genes. Using a manually curated list of 109 labeled sleep genes, we trained a prediction model on thousands of published datasets, representing circadian, immune, sleep deprivation, and many other processes. Our predictions fit with prior knowledge of sleep regulation and also identify several key genes/pathways to pursue in follow-up studies. We tested one of our findings, the NF-κB pathway, and showed that its genetic alteration affects sleep duration in mice. Our study highlights the power of ML to integrate prior knowledge and genome-wide data to study genetic regulation of sleep and other complex behaviors.

Summary: Detecting periodicity in large scale data remains a challenge. Different algorithms offer strengths and weaknesses in statistical power, sensitivity to outliers, ease of use, and sampling requirements. While efforts have been made to identify best of breed algorithms, relatively little research has gone into integrating these methods in a generalizable method. Here we present MetaCycle, an R package that incorporates ARSER, JTK_CYCLE, and Lomb-Scargle to conveniently evaluate periodicity in time-series data. Availability and implementation: MetaCycle package is available on the CRAN repository (https://cran.r-project.org/web/packages/MetaCycle/index.html) and GitHub (https://github.com/gangwug/MetaCycle). Contact: hogenesch@gmail.com Supplementary information: Supplementary data are available at Bioinformatics online.

Skin is the largest organ in the body and serves important barrier, regulatory, and sensory functions. Like other tissues, skin is subject to temporal fluctuations in physiological responses under both homeostatic and stressed states. To gain insight into these fluctuations, we investigated the role of the circadian clock in the transcriptional regulation of epidermis using a hybrid experimental design, where a limited set of human subjects (n=20) were sampled throughout the 24 h cycle and a larger population (n=219) were sampled once. By looking at pairwise correlations of core clock genes in 298 skin samples, we found a robust circadian oscillator in skin at the population level. Encouraged by this, we used CYCLOPS to reconstruct the temporal order of all samples and identified hundreds of rhythmically-expressed genes at the population level in human skin. We compared these results with published time-series skin data from mouse and show strong concordance in circadian phase across species for both transcripts and pathways. Further, like blood, skin is readily accessible and a potential source of biomarkers. Using ZeitZeiger, we identified a biomarker set for human skin that is capable of reporting circadian phase to within 3 h from a single sample. In summary, we show rhythms in human skin that persist at the population scale and a path to develop robust single-sample circadian biomarkers.

Almost all life forms can detect and decode light information for adaptive advantage. Examples include the visual system, where photoreceptor signals are processed into virtual images, and the circadian system, where light entrains a physiological clock. Here we describe a pathway in mice that employs encephalopsin (OPN3, a 480 nm light responsive opsin) to mediate light responses in murine adipocytes. The adipocyte light-OPN3 pathway regulates neonatal growth in mice and is required for at least three important functions including (1) photoentrainment of a local circadian clock, (2) extracellular matrix deposition, and (3) regulation of mitochondrial content and the proportion of brite adipocytes. Furthermore, we show that the light-OPN3 pathway is required for normal levels of uncoupling protein 1 (UCP1) in white and brown adipose tissue. Consequently, neonatal Opn3 germ-line and adipocyte-conditional null mice show a reduced ability to maintain their body temperature under cold stress. This was also observed in wild-type mice deprived of blue light. We hypothesize that the adipocyte light-OPN3 pathway provides a dynamically responsive, circadian clock-integrated mechanism for regulating adipocyte function and in turn directing metabolism to thermogenesis rather than anabolism. These data indicate an important role for peripheral light sensing in mammals and may have broad implications for human health given the unnatural lighting conditions in which we live.

Studies in shift workers and model organisms link circadian disruption to breast cancer. However, molecular rhythms in non-cancerous and cancerous human breast tissues are largely unknown. We reconstructed rhythms informatically, integrating locally collected, time-stamped biopsies with public datasets. For non-cancerous tissue, the inferred order of core-circadian genes matches established physiology. Inflammatory, epithelial-mesenchymal transition (EMT), and estrogen responsiveness pathways show circadian modulation. Among tumors, clock correlation analysis demonstrates subtype-specific changes in circadian organization. Luminal A organoids and informatic ordering of Luminal A samples exhibit continued, albeit disrupted rhythms. However, CYCLOPS magnitude, a measure of global rhythm strength, varied widely among Luminal A samples. Cycling of EMT pathway genes was markedly increased in high-magnitude Luminal A tumors. Patients with high-magnitude tumors had reduced 5-year survival. Correspondingly, 3D Luminal A cultures show reduced invasion following molecular clock disruption. This study links subtype-specific circadian disruption in breast cancer to EMT, metastatic potential, and prognosis.

Abstract Multiple isozymes are encoded in the C. elegans genome for the various sphingolipid biosynthesis reactions, but the contributions of individual isozymes are characterized only in part. We developed a simple but effective reversed-phase liquid chromatography-tandem mass spectrometry (RPLC-MS/MS) method that enables simultaneous identification and quantification of ceramides (Cer), glucosylceramides (GlcCer), and sphingomyelins (SM), three important classes of sphingolipids from the same MS run. Validating this pan-sphingolipid profiling method, we show that nearly all 47 quantifiable sphingolipid species found in young adult worms were reduced upon RNA interference (RNAi) of sptl-1 or elo-5 , which are required for synthesis of the id17:1 sphingoid base. We also confirm that HYL-1 and HYL-2, but not LAGR-1, constitute the major ceramide synthase activity with different preference for fatty acid substrates, and that CGT-3 plays a greater role than CGT-1 does in producing glucosylceramides. Intriguingly, lagr-1 RNAi lowers the abundance of all sphingomyelin species and that of several glucosylceramide species, which suggests that LAGR-1 may have functions beyond what is predicted. Additionally, RNAi of sms-1, −2, and -3 all lower the abundance of sphingomyelins with an odd number of carbon atoms (mostly C21 and C23, with or without hydroxylation) in the N-acyl chain, and only sms-1 RNAi does not elevate sphingomyelins containing even-numbered N-acyl chains. This suggests that sphingolipids containing even-numbered N-acyl chains could be regulated separately, sometimes in opposite directions, with those containing odd-numbered N-acyls, presumably monomethyl branched chain fatty acyls. We also find that ceramide levels are kept in balance with those of glucosylceramides and sphingomyelins.

Hospitals operate 24 hours a day, and it is assumed that critical decisions occur continuously around the clock. However, many aspects of hospital operation occur at particular times of day, including medical team rounding and shift changes. It is unclear if this impacts patient care, as an empirical account of 24 h treatment patterns is lacking. We analyzed the daily distribution of ~120K doses of 12 separate drugs in 1,486 inpatients at a major childrens hospital in the U.S. Treatment orders and administration were strongly time-of-day-dependent, marked by distinct morning time surges and overnight lulls. These 24 h rhythms in treatment were remarkably consistent across drugs, diagnoses, and hospital units. In sum, nearly one-third of all 116,975 orders for treatment were placed between 8 AM and 12 PM. This rhythm in hospital medicine coincided with medical team rounding time, not necessarily immediate medical need. Lastly, we show that the clinical response to hydralazine, an acute antihypertensive, is dosing time-dependent and greatest at night, when the fewest doses were administered. The prevailing dogma is that hospital treatment is administered as needed regardless of time of day. Our findings challenge this notion and reveal a potential operational barrier to best clinical care.

Background For circadian medicine to influence health, such as when to take a drug or undergo a procedure, a practical way to measure body time is needed. Recent machine learning algorithms show that gene expression data from blood and skin can provide reliable estimates of body time. However, for clinical viability, a biomarker must be easily measured and generalizable to a broad population. It is not clear that any circadian biomarker yet satisfies these criteria.Results We analyzed 24 h molecular rhythms in human dermis and epidermis at three distinct body sites, leveraging both longitudinal and population data. Circadian clock function was strongest in the epidermis, regardless of body site. We identified a 12-gene biomarker set that reported circadian phase to within 3 hours from a single sample of epidermis—the skin’s most superficial layer. This set performed well across body sites, ages, sexes, and detection platforms.Conclusions This research shows that the clock in epidermis is more robust than dermis regardless of body site. To encourage ongoing validation of this biomarker in diverse populations, diseases, and experimental designs, we developed SkinPhaser—a user-friendly app to test biomarker performance in datasets ( ).

Abstract Disruption of the circadian clock is linked to cancer development and progression. Establishing this connection has proven beneficial for understanding cancer pathogenesis, determining prognosis, and uncovering novel therapeutic targets. However, barriers to characterizing the circadian clock in human pancreas and human pancreatic cancer – one of the deadliest malignancies – have hindered an appreciation of its role in this cancer. Here, we employed normalized coefficient of variation (nCV) and clock correlation analysis in human population-level data to determine the functioning of the circadian clock in pancreas cancer and adjacent normal tissue. We found a substantially attenuated clock in the pancreatic cancer tissue. Then we exploited our existing mouse pancreatic transcriptome data to perform an analysis of the human normal and pancreas cancer samples using a machine learning method, cyclic ordering by periodic structure (CYCLOPS). Through CYCLOPS ordering, we confirmed the nCV and clock correlation findings of an intact circadian clock in normal pancreas with robust cycling of several core clock genes. However, in pancreas cancer, there was a loss of rhythmicity of many core clock genes with an inability to effectively order the cancer samples, providing substantive evidence of a dysregulated clock. The implications of clock disruption were further assessed with a Bmal1 knockout pancreas cancer model, which revealed that an arrhythmic clock caused accelerated cancer growth and worse survival, accompanied by chemoresistance and enrichment of key cancer-related pathways. These findings provide strong evidence for clock disruption in human pancreas cancer and demonstrate a link between circadian disruption and pancreas cancer progression. Author Summary The circadian clock is a regulator of human homeostasis. Dysfunction of the clock can lead to the development of diseases, including cancer. Although several cancers have been shown to have a dysfunctional clock which may alter prognosis or change treatment, this has been suggested but not demonstrated in pancreatic cancer. Investigation of this link is important because pancreatic cancer is highly lethal with few effective treatment options. Here we use recently pioneered bioinformatics approaches to assess clock functionality in human pancreatic cancer specimens, where we demonstrate that the clock is dysfunctional relative to normal pancreatic tissue. We then knocked out the core clock gene, Bmal1 , in pancreatic cancer cells, which led to faster tumor growth and worse survival in mice and enhanced chemotherapeutic resistance to standard chemotherapy agents used in the treatment of pancreatic cancer. Collectively, our findings establish human pancreatic cancer as having clock dysfunction and clock dysfunction causing a more aggressive cancer.