Abstract Fluctuating conditions and diverse stresses are typical in natural environments. In response, cells mount complex responses across multiple scales, including adjusting their shape to withstand stress. In enterobacteria, the Rcs phosphorelay is activated by cell envelope damage and by changes to periplasmic dimensions and cell width. Here, we investigated the physiological and morphological consequences of Rcs activation in Escherichia coli in the absence of stresses, using an inducible version of RcsF that mislocalizes to the inner membrane, RcsF IM . Expression of RcsF IM immediately reduced cellular growth rate and the added length per cell cycle in a manner that was directly dependent on induction levels, but independent of Rcs-induced capsule production. At the same time, cells increased intracellular concentration of the cell division protein FtsZ, and decreased the distance between division rings in filamentous cells. Depletion of the Rcs negative regulator IgaA phenocopied RcsF IM induction, indicating that IgaA is essential due to growth inhibition in its absence. However, A22 treatment did not affect growth rate or FtsZ intracellular concentration, despite activating the Rcs system. These findings suggest that the effect of Rcs activation on FtsZ levels is mediated indirectly through growth-rate changes, and highlight feedbacks among the Rcs stress response, growth dynamics, and cell-size control.

Immune cells need to swiftly and effectively respond to invading pathogens. This response relies heavily on rapid protein synthesis and accurate cellular targeting to ensure pathogen destruction. In return, pathogens intercept this response to ensure their survival and proliferation. To gain insight into this dynamic interface, we combined click-chemistry with pulsed stable isotope labeling of amino acids (pSILAC-AHA) in cell culture to quantify the newly synthesised host proteome during macrophage infection with the model intracellular bacterial pathogen, Salmonella enterica Typhimurium (STm). We monitored newly synthesised proteins across different host cell compartments and infection stages, and used available proteomics data in response to lipopolysaccharide to deconvolute the STm-specific response. Within this rich resource, we detected aberrant trafficking of lysosomal proteases to the extracellular space and the nucleus, the latter of which correlated with signatures of cell death. Pharmacological cathepsin inhibition suppressed Caspase-11 dependent macrophage cell death, thus demonstrating an active role for cathepsins during STm induced pyroptosis. Our study illustrates that resolving host proteome dynamics during infection can drive the discovery of biological mechanisms at the host-microbe interface.

The molecular architecture and function of the Gram-negative bacterial cell envelope is dictated by protein composition and localization. Proteins that localize to the inner (IM) and outer (OM) membranes of Gram-negative bacteria play critical and distinct roles in cellular physiology, however, approaches to systematically interrogate their distribution across both membranes and the soluble cell fraction are lacking. We employed multiplexed quantitative mass spectrometry to assess membrane protein localization in a proteome-wide fashion by separating IM and OM vesicles from exponentially growing E. coli K-12 cells on a sucrose density gradient. The migration patterns for >1600 proteins were classified in an unbiased manner, accurately recapitulating decades of knowledge in membrane protein localization in E. coli. For 559 proteins that are currently annotated as peripherally associated to the IM (Orfanoudaki and Economou, 2014) and display potential for dual localization to either the IM or cytoplasm, we could allocate 110 to the IM and 206 as soluble based on their fractionation patterns. In addition, we uncovered 63 cases, in which our data disagreed with current localization annotation in protein databases. For 42 of them, we were able to find supportive evidence for our localization findings in literature. We anticipate our systems-level analysis of the E. coli membrane proteome will serve as a useful reference dataset to query membrane protein localization, as well as provide a novel methodology to rapidly and systematically map membrane protein localization in more poorly characterized Gram-negative species.

Abstract The Rcs signal transduction system is a phosphorelay responsible for sensing a wide variety of enterobacterial cell envelope stresses. In Escherichia coli , the Rcs system is required to survive A22 and mecillinam treatment, two drugs that perturb cell size. To test whether cell size changes might be correlated with envelope damage and thereby sensed by the Rcs system, we tuned E. coli cell size via drug inhibition with A22, point mutations to the cell-shape determinant MreB, and mechanically confined growth. In all conditions, cell width was strongly correlated with Rcs activation, with wider cells exhibiting more activation than wild-type. In all conditions, RcsF, the outer membrane-localized upstream component of the Rcs system, was essential for responding to cell width changes. Consistently, several envelope gene deletions known to induce the Rcs system via RcsF resulted in cells that were wider than wild-type. Cryo- electron microscopy revealed that the periplasm of a wide MreB mutant was on average ∼3 nm thinner than wild-type, thereby bringing RcsF closer to the downstream components of the signaling cascade in the inner membrane. Conversely, extending the flexible linker region of RcsF by ∼3 nm increased Rcs activity in wild-type cells. In summary, we propose that the Rcs system responds to changes in cell width because of altered periplasmic thickness.