Abstract A large number of RNA modifications are known to affect processing and function of rRNA, tRNA and mRNA 1 . The N4-acetylcytidine (ac4C) is the only known RNA acetylation event and is known to occur on rRNA, tRNA and mRNA 2,3 . RNA modification by acetylation affects a number of biological processes, including translation and RNA stability 2 . For a few RNA methyl modifications, a reversible nature has been demonstrated where specific writer proteins deposit the modification and eraser proteins can remove them by oxidative demethylation 4–6 . The functionality of RNA modifications is often mediated by interaction with reader proteins that bind dependent on the presence of specific modifications 1 . The NAT10 acetyltransferase has been firmly identified as the main writer of acetylation of cytidine ribonucleotides, but so far neither readers nor erasers of ac4C have been identified 2,3 . Here we show, that ac4C is bound by the nucleolar protein NOP58 and deacetylated by SIRT7, for the first time demonstrating reversal by another mechanism than oxidative demethylation. NOP58 and SIRT7 are involved in snoRNA function and pre-ribosomal RNA processing 7–10 , and using a NAT10 deficient cell line we can show that the reduction in ac4C levels affects both snoRNA sub-nuclear localization and pre-rRNA processing. SIRT7 can deacetylate RNA in vitro and endogenous levels of ac4C on snoRNA increase in a SIRT7 deficient cell line, supporting its endogenous function as an RNA deacetylase. In summary, we identify the first eraser and reader proteins of the RNA modification ac4C, respectively, and suggest an involvement of RNA acetylation in snoRNA function and pre-rRNA processing.

Abstract The quest to model and modulate embryonic development became a recent cornerstone of stem cell and developmental biology. Mammalian developmental timing is adjustable in vivo by preserving preimplantation embryos in a dormant state called diapause. Inhibition of the growth regulator mTOR (mTORi) pauses mouse development in vitro, yet constraints to pause duration are unrecognized. By comparing the response of embryonic and extraembryonic stem cells to mTORi-induced pausing, we identified lipid usage as a bottleneck to developmental pausing. Enhancing fatty acid oxidation (FAO) boosts embryo longevity, while blocking it reduces the pausing capacity. Genomic and metabolic analyses of single embryos point toward a deeper dormant state in FAO-enhanced pausing and reveal a link between lipid metabolism and embryo morphology. Our results lift a constraint on in vitro embryo survival and suggest that lipid metabolism may be a critical metabolic transition relevant for longevity and stem cell function across tissues. One-Sentence Summary Facilitating fatty acid oxidation by carnitine supplementation enhances mTOR inhibition-mediated developmental pausing.

Summary Transcription factors are among the most attractive therapeutic targets but are considered largely undruggable due to the intrinsically disordered nature of their activation domains. Here we show that the aromatic character of the activation domain of the androgen receptor, a therapeutic target for castration resistant prostate cancer, is key for its activity as a transcription factor by allowing it to partition into transcriptional condensates. Based on this knowledge we optimized the structure of a small molecule inhibitor, previously identified by phenotypic screening, that targets a specific transactivation unit within the domain that is partially folded and rich in aromatic residues. The optimized compounds had more affinity for their target, inhibited androgen receptor-dependent transcriptional programs, and had antitumorigenic effect in models of castration-resistant prostate cancer in cells and in vivo . These results establish a generalizable framework to target small molecules to the activation domains of oncogenic transcription factors and other disease-associated proteins with therapeutic intent.

ABSTRACT The cellular microenvironment together with intrinsic regulators shapes stem cell identity and differentiation capacity. Mammalian early embryos are exposed to hypoxia in vivo and appear to benefit from hypoxic culture in vitro. Yet, components of the hypoxia response and how their interplay impacts stem cell transcriptional networks and lineage choices remain poorly understood. Here we investigated the molecular effects of acute and prolonged hypoxia on distinct embryonic and extraembryonic stem cell types as well as the functional impact on differentiation potential. We find a temporal and cell type-specific transcriptional response including an early primitive streak signature in hypoxic embryonic stem (ES) cells. Using a 3D gastruloid differentiation model, we show that hypoxia-induced T expression enables symmetry breaking and axial elongation in the absence of exogenous WNT activation. Importantly, hypoxia also modulates T levels in conventional gastruloids and enhances representation of endodermal and neural markers. Mechanistically, we identify Hif1α as a central factor that mediates the transcriptional response to hypoxia in balance with epigenetic and metabolic rewiring. Our findings directly link the microenvironment to stem cell function and provide a rationale supportive of applying physiological conditions in models of embryo development

Abstract Papillary renal cell carcinoma (pRCC) is a malignant kidney cancer with a prevalence of 7-20% of all renal tumors. Proteome and metabolome profiles of 19 pRCC and patient-matched healthy kidney controls were used to elucidate the regulation of metabolic pathways and the underlying molecular mechanisms. Glutathione (GSH), a main reactive oxygen species (ROS) scavenger, was highly increased and can be regarded as a new hallmark in this malignancy. Isotope tracing of pRCC derived cell lines revealed an increased de novo synthesis rate of GSH, based on glutamine consumption. Furthermore, rewiring of the main pathways involved in ATP and glucose synthesis was observed at the protein level. In contrast, transcripts encoding for the respiratory chain were not regulated, which prompts for non-genetic profiling. The molecular characteristics of pRCC are increased GSH synthesis to cope with ROS stress, deficient anabolic glucose synthesis, and compromised oxidative phosphorylation, which could potentially be exploited in innovative anti-cancer strategies. SIGNIFICANCE STATEMENT We applied proteome- and metabolome profiling to elucidate molecular features in malign papillary renal cell carcinomas. By this characterization, a reprogramming of the main metabolic pathways, such as gluconeogenesis and fatty acid- and amino acid metabolism were identified. The proteins involved in the respiratory chain and the corresponding enzymatic activities were strongly reduced in pRCC, showing an anti-correlation compared with the transcriptome. Similar to renal oncocytomas, the ROS scavenger glutathione was identified as a hallmark in pRCC. Our results suggest that impaired metabolism and dysfunctional mitochondria determine the fate of pRCC. Furthermore, we propose that the specific regulation of the mitochondrial respiratory chain can differentiate highly similar malignant pRCCs from benign renal oncocytomas.

Abstract Background Neurofibromatosis type 1 (NF1) is a multi-organ disease caused by mutations in Neurofibromin (NF1). Amongst other features, NF1 patients frequently show reduced muscle mass and strength, impairing patients’ mobility and increasing the risk of fall. The role of Nf1 in muscle and the cause for the NF1-associated myopathy is mostly unknown. Methods To dissect the function of Nf1 in muscle, we created muscle-specific knockout mouse models for Nf1, inactivating Nf1 in the prenatal myogenic lineage either under the Lbx1 promoter or under the Myf5 promoter. Mice were analyzed during pre-and postnatal myogenesis and muscle growth. Results Nf1 Lbx1 and Nf1 Myf5 animals showed only mild defects in prenatal myogenesis. Nf1 Lbx1 animals were perinatally lethal, while Nf1 Myf5 animals survived only up to approx. 25 weeks. A comprehensive phenotypic characterization of Nf1 Myf5 animals showed decreased postnatal growth, reduced muscle size, and fast fiber atrophy. Proteome and transcriptome analysis of muscle tissue indicated decreased protein synthesis and increased proteasomal degradation, and decreased glycolytic and increased oxidative activity in muscle tissue. High-resolution respirometry confirmed enhanced oxidative metabolism in Nf1 Myf5 muscles, which was concomitant to a fiber type shift from type 2B to type 2A and type 1. Moreover, Nf1 Myf5 muscles showed hallmarks of decreased activation of mTORC1 and increased expression of atrogenes. Remarkably, loss of Nf1 promoted a robust activation of AMPK with a gene expression profile indicative of increased fatty acid catabolism. Additionally, we observed a strong induction of genes encoding catabolic cytokines in muscle Nf1 Myf5 animals, in line with a drastic reduction of white, but not brown adipose tissue. Conclusions Our results demonstrate a cell-autonomous role for Nf1 in myogenic cells during postnatal muscle growth required for metabolic and proteostatic homeostasis. Furthermore, Nf1 deficiency in muscle drives cross-tissue communication and mobilization of lipid reserves.

The nucleus of higher eukaryotes is a highly compartmentalized and dynamic organelle consisting of several biomolecular condensates that regulate gene expression at multiple levels (1, 2). First reported more than 100 years ago by Ramon y Cajal, nuclear speckles (NS) are among the most prominent of such condensates (3). Despite their prevalence, research on the function of NS is virtually restricted to colocalization analyses, since an organizing core, without which NS cannot form, remains unidentified (4, 5). The monoclonal antibody SC35, which was raised against a spliceosomal extract, is a frequently used reagent to mark NS since its debut in 1990 (6). Unexpectedly, we found that this antibody has been misidentified and the main target of SC35 mAb is SRRM2, a large (∼300 kDa), spliceosomeassociated (7) protein with prominent intrinsically disordered regions (IDRs) that sharply localizes to NS (8). Here we show that, the elusive core of NS is formed by SON and SRRM2, since depletion of SON leads only to a partial disassembly of NS, while combined depletion of SON together with SRRM2, but not other NS associated factors, or depletion of SON in a cell line where IDRs of SRRM2 are genetically deleted, leads to a near-complete dissolution of NS. This work, therefore, paves the way to study the role of NS under diverse physiological and stress conditions.

Abstract Expansion of the glutamine tract (poly-Q) in the protein huntingtin (HTT) causes the neurodegenerative disorder Huntington’s disease (HD). Emerging evidence suggests that mutant HTT (mHTT) disrupts brain development. To gain mechanistic insights into the neurodevelopmental impact of human mHTT, we engineered male induced pluripotent stem cells to introduce a biallelic or monoallelic mutant 70Q expansion or to remove the poly-Q tract of HTT. The introduction of a 70Q mutation caused aberrant development of cerebral organoids with loss of neural progenitor organization. The early neurodevelopmental signature of mHTT highlighted the dysregulation of the protein coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 2 (CHCHD2), a transcription factor involved in mitochondrial integrated stress response. CHCHD2 repression was associated with abnormal mitochondrial morpho-dynamics that was reverted upon overexpression of CHCHD2. Removing the poly-Q tract from HTT normalized CHCHD2 levels and corrected key mitochondrial defects. Hence, mHTT-mediated disruption of human neurodevelopment is paralleled by aberrant neurometabolic programming mediated by dysregulation of CHCHD2, which could then serve as an early interventional target for HD.

Arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) form symbioses with approximately 80% of plant species and potentially benefit their hosts (e.g. nutrient acquisition) and the soil environment (e.g. soil aggregation). AMF also affect soil microbiota and soil multifunctionality. We manipulated AMF presence (via inoculation of non-sterile soil with Rhizophagus irregularis and using a hyphal compartment design) and used RNA-seq and metaproteomics to assess AMF roles in soil. The results indicated that AMF drove an active soil microbial community expressing transcripts and proteins related to nine metabolic functions, including the metabolism of C and N. We suggest two possible mechanisms: 1) the AMF hyphae produce exudates that select a beneficial community, or, 2) the hyphae compete with other soil microbes for available nutrients and consequently induce the community to mineralize nutrients from soil organic matter. We also identified candidate proteins that are potentially related to soil aggregation, such as Lpt and HSP60. Our results bridge microbial ecology and ecosystem functioning. We show that the AMF hyphosphere contains an active community related to soil respiration and nutrient cycling, thus potentially improving nutrient mineralization from soil organic matter and nutrient supply to the plants.

Summary Stress granules are an integral part of the stress response that are formed from non-translating mRNAs aggregated with proteins. While much is known about stress granules, the factors that drive their mRNA localization are incompletely described. Modification of mRNA can alter the properties of the nucleobases and affect processes as translation, splicing and localization of individual transcript. Here, we show that the RNA modification N4-acetylcytidine (ac4C) on mRNA associates with transcripts enriched in stress granules and that stress granule localized transcripts with ac4C are particularly translationally regulated. In addition, we show that ac4C on mRNA can mediate co-localization of the protein NOP58 to stress granules. Our results show that acetylation of mRNA regulates localization of both stress-sensitive transcripts and RNA-binding proteins to stress granules and adds to our understanding of the molecular mechanisms responsible for stress granule formation.