ABSTRACT The human genome contains numerous duplicated regions, such as parent-pseudogene pairs, causing sequencing reads to align equally well to either gene. The extent to which this ambiguity complicates transcriptomic analyses is currently unknown. This is concerning as many parent genes have been linked to disease, including GBA1, causally linked to both Parkinson’s and Gaucher disease. We find that most of the short sequencing reads that map to GBA1 , also map to its pseudogene, GBAP1 . Using long-read RNA-sequencing in human brain, where all reads mapped uniquely, we demonstrate significant differences in expression compared to short-read data. We identify novel transcripts from both GBA1 and GBAP1 , including protein-coding transcripts that are translated in vitro and detected in proteomic data, but that lack GCase activity. By combining long-read with single-nuclear RNA-sequencing to analyse brain-relevant cell types we demonstrate that transcript expression varies by brain region with cell-type-selectivity. Taken together, these results suggest a non-lysosomal function for both GBA1 and GBAP1 in brain. Finally, we demonstrate that inaccuracies in annotation are widespread among parent genes, with implications for many human diseases.

Abstract Although next-generation sequencing technologies have accelerated the discovery of novel gene-to-disease associations, many patients with suspected Mendelian diseases still leave the clinic without a genetic diagnosis. An estimated one third of these patients will have disorders caused by mutations impacting splicing. RNA-sequencing has been shown to be a promising diagnostic tool, however few methods have been developed to integrate RNA-sequencing data into the diagnostic pipeline. Here, we introduce dasper , an R/Bioconductor package that improves upon existing tools for detecting aberrant splicing by using machine learning to incorporate disruptions in exon-exon junction counts as well as coverage. dasper is designed for diagnostics, providing a rank-based report of how aberrant each splicing event looks, as well as including visualization functionality to facilitate interpretation. We validate dasper using 16 patient-derived fibroblast cell lines harbouring pathogenic variants known to impact splicing. We find that dasper is able to detect pathogenic splicing events with greater accuracy than existing LeafCutterMD or z-score approaches. Furthermore, by only applying a broad OMIM gene filter (without any variant-level filters), dasper is able to detect pathogenic splicing events within the top 10 most aberrant identified for each patient. Since using publicly available control data minimises costs associated with incorporating RNA-sequencing into diagnostic pipelines, we also investigate the use of 504 GTEx fibroblast samples as controls. We find that dasper leverages publicly available data effectively, ranking pathogenic splicing events in the top 25. Thus, we believe dasper can increase diagnostic yield for a pathogenic splicing variants and enable the efficient implementation of RNA-sequencing for diagnostics in clinical laboratories.

Mutations in GBA1 cause Gaucher disease and are the most important genetic risk factor for Parkinson’s disease. However, analysis of transcription at this locus is complicated by its highly homologous pseudogene, GBAP1 . We show that >50% of short RNA-sequencing reads mapping to GBA1 also map to GBAP1 . Thus, we used long-read RNA sequencing in the human brain, which allowed us to accurately quantify expression from both GBA1 and GBAP1 . We discovered significant differences in expression compared to short-read data and identify currently unannotated transcripts of both GBA1 and GBAP1 . These included protein-coding transcripts from both genes that were translated in human brain, but without the known lysosomal function—yet accounting for almost a third of transcription. Analyzing brain-specific cell types using long-read and single-nucleus RNA sequencing revealed region-specific variations in transcript expression. Overall, these findings suggest nonlysosomal roles for GBA1 and GBAP1 with implications for our understanding of the role of GBA1 in health and disease.

Abstract There is growing evidence for the importance of 3’ untranslated region (3’UTR) dependent regulatory processes. However, our current human 3’UTR catalogue is incomplete. Here, we developed a machine learning-based framework, leveraging both genomic and tissue-specific transcriptomic features to predict previously unannotated 3’UTRs. We identify unannotated 3’UTRs associated with 1,513 genes across 39 human tissues, with the greatest abundance found in brain. These unannotated 3’UTRs were significantly enriched for RNA binding protein (RBP) motifs and exhibited high human lineage-specificity. We found that brain-specific unannotated 3’UTRs were enriched for the binding motifs of important neuronal RBPs such as TARDBP and RBFOX1 , and their associated genes were involved in synaptic function and brain- related disorders. Our data is shared through an online resource F3UTER ( https://astx.shinyapps.io/F3UTER/ ). Overall, our data improves 3’UTR annotation and provides novel insights into the mRNA-RBP interactome in the human brain, with implications for our understanding of neurological and neurodevelopmental diseases.

Highlights•Hyperactivity associated with moderate hearing loss in ENU-induced whirlin mutant•Overexpression of C-terminus whirlin in the brain rescues hyperactive behaviors•Transcriptional profile of whirlin across tissues underscores pleiotropy•Qualitative deficit in the temporal processing of the acoustic stimulusSummaryDespite some evidence indicating diverse roles of whirlin in neurons, the functional corollary of whirlin gene function and behavior has not been investigated or broadly characterized. A single nucleotide variant was identified from our recessive ENU-mutagenesis screen at a donor-splice site in whirlin, a protein critical for proper sensorineural hearing function. The mutation (head-bob, hb) led to partial intron-retention causing a frameshift and introducing a premature termination codon. Mutant mice had a head-bobbing phenotype and significant hyperactivity across several phenotyping tests. Lack of complementation of head-bob with whirler mutant mice confirmed the head-bob mutation as functionally distinct with compound mutants having a mild-moderate hearing defect. Utilizing transgenics, we demonstrate rescue of the hyperactive phenotype and combined with the expression profiling data conclude whirlin plays an essential role in activity-related behaviors. These results highlight a pleiotropic role of whirlin within the brain and implicate alternative, central mediated pathways in its function.Graphical abstract