Summary Hypoplastic left heart syndrome (HLHS) is a severe congenital heart defect with 30% mortality from heart failure (HF) in the first year of life, but why only some patients suffer early-HF and its cause remain unknown. Modeling using induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSC-CM) showed early-HF patient iPSC-CM have increased apoptosis, redox stress, and failed antioxidant response. This was associated with mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening, mitochondrial hyperfusion and respiration defects. Whereas iPSC-CM from patients without early-HF had hyper-elevated antioxidant response with increased mitochondrial fission and mitophagy. Single cell transcriptomics showed dichotomization by HF outcome, with mitochondrial dysfunction and endoplasmic reticulum (ER) stress associated with early-HF. Importantly, oxidative stress and apoptosis associated with early HF were rescued by sildenafil inhibition of mPTP opening or TUDCA suppression of ER stress. Together these findings demonstrate a new paradigm for modeling clinical outcome in iPSC-CM, demonstrating uncompensated mitochondrial oxidative stress underlies early HF in HLHS.

Abstract Heart organoids have the potential to generate primary heart-like anatomical structures and hold great promise as in vitro models for cardiac disease. However, their properties have not yet been carefully studied, which hinders a wider spread application. Here we report the development of differentiation systems for ventricular and atrial heart organoids, enabling the study of heart disease with chamber defects. We show that our systems generate organoids comprising of major cardiac cell types, and we used single cell RNA sequencing together with sample multiplexing to characterize the cells we generate. To that end, we also developed a machine learning label transfer approach lever-aging cell type, chamber, and laterality annotations available for primary human fetal heart cells. We then used this model to analyze organoid cells from an isogeneic line carrying an Ebstein’s anomaly associated genetic variant, and we successfully recapitulated the disease’s atrialized ventricular defects. In summary, we have established a workflow integrating heart organoids and computational analysis to model heart development in normal and disease states.

Abstract Left-right patterning disturbance can cause severe birth defects, but it remains least understood of the three body axes. We uncovered an unexpected role for metabolic regulation in left-right patterning. Analysis of the first spatial transcriptome profile of left-right patterning revealed global activation of glycolysis, accompanied by right-sided expression of Bmp7 and genes regulating insulin growth factor signaling. Cardiomyocyte differentiation was left-biased, which may underlie the specification of heart looping orientation. This is consistent with known Bmp7 stimulation of glycolysis and glycolysis suppression of cardiomyocyte differentiation. Liver/lung laterality may be specified via similar metabolic regulation of endoderm differentiation. Myo1d , found to be left-sided, was shown to regulate gut looping in mice, zebrafish, and human. Together these findings indicate metabolic regulation of left-right patterning. This could underlie high incidence of heterotaxy-related birth defects in maternal diabetes, and the association of PFKP, allosteric enzyme regulating glycolysis, with heterotaxy. This transcriptome dataset will be invaluable for interrogating birth defects involving laterality disturbance.

ABSTRACT The kidney is a complex organ composed of more than 30 terminally differentiated cell types that all are required to perform its numerous homeostatic functions. Defects in kidney development are a significant cause of chronic kidney disease in children, which can lead to kidney failure that can only be treated by transplant or dialysis. A better understanding of molecular mechanisms that drive kidney development is important for designing strategies to enhance renal repair and regeneration. In this study, we profiled gene expression in the developing mouse kidney at embryonic day 14.5 at single cell resolution. Consistent with previous studies, clusters with distinct transcriptional signatures clearly identify major compartments and cell types of the developing kidney. Cell cycle activity distinguishes between the “primed” and “self-renewing” sub-populations of nephron progenitors, with increased expression of the cell cycle related genes Birc5, Cdca3, Smc2 and Smc4 in “primed” nephron progenitors. Augmented Birc5 expression was also detected in immature distal tubules and a sub-set of ureteric bud cells, suggesting that Birc5 might be a novel key molecule required for early events of nephron patterning and tubular fusion between the distal nephron and the collecting duct epithelia.

Abstract Background Hypoplastic left heart syndrome (HLHS), a severe congenital heart disease, is associated with poor neurodevelopmental outcomes, microcephaly, reduced cortical brain volume, brain dysmaturation, and neurobehavioral disorders such as autism. The involvement of patient intrinsic factors was indicated, but the mechanism is largely unknown. Methods Ohia mice with HLHS causing mutations in chromatin modifier Sin3A-associated protein 130 ( Sap130 ) and cell adhesion protein ProtocadherinA9 ( Pcdha9) were investigated for brain abnormalities by histology, immunomicroscopy, and molecular profiling by RNAseq, Sap130 ChIPseq, and genome-wide methylome analysis. Additionally, adult viable Pcdha9 m/m and Emx1-cre:Sap130 f/− mice with forebrain deletion of Sap130 were examined by brain MRI and behavioral assessments. Results Ohia mice have brain abnormalities comprising forebrain hypoplasia and microcephaly in conjunction with a cortical neurogenesis defect. This is associated with loss of intermediate progenitors due to mitotic arrest and apoptosis from multipolar spindle formation, a mechanism also observed in primary microcephaly. Brain RNAseq showed perturbation of REST transcriptional regulation of neurogenesis, disruption of CREB signaling regulating synaptic plasticity and memory, and defects in neurovascular coupling indicating perturbation of brain-sparing cerebral autoregulation. Disease pathways recovered included autism, intellectual disability, and other neurobehavioral/neurological deficits. These same pathways were observed upon intersection of genes that are differentially expressed with those that are differentially methylated and also are ChIPseq targets of Sap130, suggesting the transcriptional changes are epigenetically regulated. Adult viable mice harboring either the Pcdha9 mutation or forebrain-specific Sap130 deletion showed similar learning/memory deficits and autism-like behavior, suggesting they act on convergent pathways. Conclusions Our observations indicate the intrinsic factors contributing to the adverse neurodevelopmental outcome associated with HLHS involve spindle defects causing impaired corticoneurogenesis, and brain and behavioral deficits associated with perturbed epigenetic regulation of neurodevelopmental pathways. Novelty and Significance What is known? Hypoplastic left heart syndrome (HLHS), a severe congenital heart disease, is associated with adverse neurodevelopmental outcome attributable to patient intrinsic factors. Cortical neurogenesis defect with reduced brain volume and microcephaly are observed beginning in utero, suggesting a developmental etiology. Learning impairment and autism spectrum disorder are commonly observed in HLHS. What new information does this article contribute? The Ohia HLHS mouse model exhibits neurodevelopmental deficits comprising microcephaly and cortical neurogenesis defects with loss of neural progenitors from multipolar spindle formation, as well as impaired neurovascular coupling. Molecular profiling showed disturbance of REST, transcriptional regulator of neural stem cells, and CREB signaling regulating synaptic plasticity, with neurobehavioral assessments of the mutant mice showing learning/memory and autism-like behavioral deficits. Intersection of transcriptome and DNA methylation analyses uncovered an epigenetic basis for the neurodevelopmental/neurobehavioral abnormalities, Analysis of an HLHS mouse model indicated patient intrinsic factors causing adverse neurodevelopment in HLHS are genetic and epigenetic in etiology. This may include a mitotic spindle defect that would not be rescued by in utero aortic valvuloplasty, and a defect in neurovascular coupling that is likely to reduce the efficacy of maternal hyperoxygenation. However, epigenetic therapy may provide a new avenue for treatment that should be explored.

One million patients with congenital heart disease (CHD) live in the US. They have a lifelong risk of developing heart failure. Current concepts do not sufficiently address mechanisms of heart failure development specifically for these patients. We show that cardiomyocyte cytokinesis failure is increased in tetralogy of Fallot with pulmonary stenosis (ToF/PS), a common form of CHD. Labeling of a ToF/PS baby with isotope-tagged thymidine showed cytokinesis failure after birth. We used single-cell transcriptional profiling to discover that the underlying mechanism is repression of the cytokinesis gene ECT2, and show that this is downstream of β-adrenergic receptors (β-AR). Inactivation of the β-AR genes and administration of the β-blocker propranolol increased cardiomyocyte division in neonatal mice, which increased the endowment and conferred benefit after myocardial infarction in adults. Propranolol enabled the division of ToF/PS cardiomyocytes. These results suggest that β-blockers should be evaluated for increasing cardiomyocyte division in patients with ToF/PS and other types of CHD.

Motivation: Single cell RNA sequencing (scRNA-seq) technologies enable the study of transcriptional heterogeneity at the resolution of individual cells and have an increasing impact on biomedical research. Specifically, high-throughput approaches that employ micro-fluidics in combination with unique molecular identifiers (UMIs) are capable of assaying many thousands of cells per experiment and are rapidly becoming commonplace. However, it is known that these methods sometimes wrongly consider two or more cells as single cells, and that a number of so-called doublets is present in the output of such experiments. Treating doublets as single cells in downstream analyses can severely bias a study's conclusions, and therefore computational strategies for the identification of doublets are needed. Here we present single cell doublet scoring (scds), a software tool for the in silico identification of doublets in scRNA-seq data. Results: With scds, we propose two new and complementary approaches for doublet identification: Co-expression based doublet scoring (cxds) and binary classification based doublet scoring (bcds). The co-expression based approach, cxds, utilizes binarized (absence/presence) gene expression data and employs a binomial model for the co-expression of pairs of genes and yields interpretable doublet annotations. bcds, on the other hand, uses a binary classification approach to discriminate artificial doublets from the original data. We apply our methods and existing doublet identification approaches to four data sets with experimental doublet annotations and find that our methods perform at least as well as the state of the art, but at comparably little computational cost. We also find appreciable differences between methods and across data sets, that no approach dominates all others, and we believe there is room for improvement in computational doublet identification as more data with experimental annotations becomes available. In the meanwhile, scds presents a scalable, competitive approach that allows for doublet annotations in thousands of cells in a matter of seconds. Availability and Implementation: scds is implemented as an R package and freely available at https://github.com/kostkalab/scds.