Abstract Allosteric inhibitors of mutant IDH1 or IDH2 induce terminal differentiation of the mutant leukemic blasts and provide durable clinical responses in approximately 40% of acute myeloid leukemia (AML) patients with the mutations. However, primary resistance and acquired resistance to the drugs are major clinical issues. To understand the molecular underpinnings of clinical resistance to IDH inhibitors (IDHi), we performed multipronged genomic analyses (DNA sequencing, RNA sequencing and cytosine methylation profiling) in longitudinally collected specimens from 68 IDH1- or IDH2-mutant AML patients treated with the inhibitors. The analysis revealed that leukemia stemness is a major driver of primary resistance to IDHi, whereas selection of mutations in RUNX1/CEBPA or RAS-RTK pathway genes was the main driver of acquired resistance to IDHi, along with BCOR , homologous IDH gene, and TET2 . These data suggest that targeting stemness and certain high-risk co-occurring mutations may overcome resistance to IDHi in AML.

One of the pervasive features of cancer is the diversity of mutations found in malignant cells within the same tumor; a phenomenon called clonal diversity or intratumor heterogeneity. Clonal diversity allows tumors to adapt to the selective pressure of treatment and likely contributes to the development of treatment resistance and cancer recurrence. Thus, the ability to precisely delineate the clonal substructure of a tumor, including the evolutionary history of its development and the co-occurrence of its mutations, is necessary to understand and overcome treatment resistance. However, DNA sequencing of bulk tumor samples cannot accurately resolve complex clonal architectures. Here, we performed high-throughput single-cell DNA sequencing to quantitatively assess the clonal architecture of acute myeloid leukemia (AML). We sequenced a total of 556,951 cells from 77 patients with AML for 19 genes known to be recurrently mutated in AML. The data revealed clonal relationship among AML driver mutations and identified mutations that often co-occurred (e.g., NPM1/FLT3-ITD, DNMT3A/NPM1, SRSF2/IDH2, and WT1/FLT3-ITD ) and those that were mutually exclusive (e.g., NRAS/KRAS, FLT3 -D835/ITD, and IDH1/IDH2 ) at single-cell resolution. Reconstruction of the tumor phylogeny uncovered history of tumor development that is characterized by linear and branching clonal evolution patterns with latter involving functional convergence of separately evolved clones. Analysis of longitudinal samples revealed remodeling of clonal architecture in response to therapeutic pressure that is driven by clonal selection. Furthermore, in this AML cohort, higher clonal diversity (≥4 subclones) was associated with significantly worse overall survival. These data portray clonal relationship, architecture, and evolution of AML driver genes with unprecedented resolution, and illuminate the role of clonal diversity in therapeutic resistance, relapse and clinical outcome in AML.

To enable the characterization of genetic heterogeneity in tumor cell populations, we developed a novel microfluidic approach that barcodes amplified genomic DNA from thousands of individual cancer cells confined to droplets. The barcodes are then used to reassemble the genetic profiles of cells from next generation sequencing data. Using this approach, we sequenced longitudinally collected AML tumor populations from two patients and genotyped up to 62 disease relevant loci across more than 16,000 individual cells. Targeted single-cell sequencing was able to sensitively identify tumor cells during complete remission and uncovered complex clonal evolution within AML tumors that was not observable with bulk sequencing. We anticipate that this approach will make feasible the routine analysis of heterogeneity in AML leading to improved stratification and therapy selection for the disease.

Gene expression profiling has consistently identified three molecular subtypes of lung adenocarcinoma that have prognostic implications. To facilitate stratification of patients with this disease into similar molecular subtypes, we developed and validated a simple, mutually exclusive classification using the mutational status of EGFR, KRAS, and TP53 and defined six mutually exclusive molecular subtypes. A development cohort of 283 cytology specimens of lung adenocarcinoma was used to evaluate the associations between the proposed classification and clinicopathologic variables including demographic characteristics, smoking history, fluorescence in situ hybridization and molecular results. For validation and prognostic assessment, 63 of the 283 cytology specimens with available survival data were combined with a separate cohort of 428 surgical pathology specimens of lung adenocarcinoma. The proposed classification yielded significant associations between these molecular subtypes and clinical and prognostic features. We found better overall survival in patients who underwent surgery and had tumors enriched for EGFR mutations. Worse overall survival was associated with older age, stage IV disease, and tumors with co-mutations in KRAS and TP53. Interestingly, neither chemotherapy nor radiation therapy showed benefit to overall survival. Our findings show that the mutational status of EGFR, KRAS, and TP53 can be used to easily classify lung adenocarcinoma patients into six subtypes that show a relationship with prognosis, especially in patients who underwent surgery, and these subtypes are similar to classifications based on more complex genomic methods reported previously.

ABSTRACT Background SF3B1 mutations ( SF3B1 mut ) in myelodysplastic syndromes (MDS) frequently involve codon K700E and have a favorable prognosis. The prognostic effect of non-K700E SF3B1 mut is uncertain. Methods We analyzed the clinical-pathologic features and outcomes of a single-institutional series of 94 SF3B1 mut and 415 SF3B1 wt newly diagnosed untreated MDS patients and explored the differences between K700E and non-K700E subgroups. Findings Ninety-four (19%) patients had SF3B1 mut : median age, 74 years. Fifty-five (60%) patients carried K700E. Recurrent non-K700E mutations (39, 40%) included R625, H662 and K666. Compared to SF3B1 mut K700E, non-K700E patients had a lower median ANC (1·8 vs. 2·4, p=0·005) and were frequently “high” R-IPSS (revised International Prognostic Scoring System) [7(19%) vs. 2(4%), p=0·031]. Non-K700E MDS frequently associated with RUNX1 (26% vs. 7%, p=0·012) and exclusively with BCOR, IDH2 , and SRSF2 mutations. There was no significant difference in karyotype or SF3B1 variant allele frequency. Most (∼80%) were treated with hypomethylating agents. SF3B1 mut had superior overall survival (OS) than SF3B1 wt in all MDS categories [not-reached vs. 25·2 months, p=0·0003], low-grade MDS, and MDS with ring sideroblasts (MDS-RS). Compared to SF3B1 wt , SF3B1 mut K700E had superior outcomes in all MDS categories (25 months vs. not-reached, p=0·0001), low-grade MDS, and MDS-RS, but no significant difference was seen with non-K700E. By multivariate analysis, absence of SF3B1 mut K700E (not non-K700E) independently associated with prognosis. Interpretation SF3B1 mut MDS show distinct clinical and mutational profiles, with K700E showing a significantly better OS compared to non-K700E mutations and SF3B1 wt . Our study highlights the importance of SF3B1 mutation type in MDS risk assessment. Data Sharing Statement The datasets generated during and/or analyzed during the current study are not publicly available due to patient privacy concerns but are available from the corresponding author on reasonable request. Research in Context Evidence before this study We designed this study based on the collective evidence from a systematic search of the literature for outcomes of patients MDS with SF3B1 mutations ( SF3B1 mut ) from January 2013 to June 2020. Both the International Working Group for the Prognosis of MDS (IWG-PM) proposal and 2016 revisions to the World Health Organization (WHO) Classification of Myelodysplastic Syndromes recognize SF3B1 mut MDS with <5% blasts (or ring sideroblasts >5% for WHO) as a distinct sub-category, in the absence of other unfavorable features. This was largely based on favorable prognostic outcomes, a distinct gene expression profile, and association with ring sideroblasts. However, the natural history of SF3B1 mut MDS is heterogeneous. A high proportion of SF3B1 mutations occur within codon K700, leading to large-scale mRNA downregulation due to branch point recognition error, while the rest occur outside of this codon. The downstream functional effects of SF3B1 mutations outside of the K700 codon are unclear. The clinical course of SF3B1 mut MDS patients likely depends on the type of SF3B1 mutation and other features such as variant allele frequency, concomitant gene mutations, and karyotype. Until now, the effects of the different types of SF3B1 mutations were largely unknown. Added value of this study In this study, we report distinctive clinicopathologic characteristics and outcomes of MDS patients with SF3B1 mutations segregated based on mutation type: K700E vs. non-K700E. We show that ∼40% of SF3B1 mutated MDS patients have non-K700E mutations. Non-K700E SF3B1 mut MDS have distinct clinico-pathologic features, such as lower ANC and frequent association with mutations in RUNX1, BCOR, IDH2 , and SRSF2 . There was no significant difference in karyotype or SF3B1 variant allele frequency. Importantly, K700E SF3B1 mut MDS had superior overall survival compared to SF3B1 wt , in all MDS, low-grade MDS, and MDS with ring sideroblasts, but no significant difference was seen with non-K700E. By multivariate analysis, absence of SF3B1 mut K700E, but not non-K700E, independently associated with prognosis. Implications of all the available evidence To the best of our knowledge, this is the first study to report these findings from a single-institutional series of MDS primarily treated with hypomethylating agents. Our study highlights the importance of determining the SF3B1 mutation type in MDS risk assessment. These findings are important in light of the recent FDA approval of luspatercept based on the results of the MEDALIST trial that suggested sustained hematological responses in SF3B1 mut MDS patients.

ABSTRACT There is limited data on the clonal mechanisms underlying leukemogenesis, prognostic factors, and optimal therapy for atypical chronic myeloid leukemia (aCML). We evaluated the clinicopathological features, outcomes, and responses to therapy of 65 patients with aCML. Median age was 67 years (range 46-89). The most frequently mutated genes included ASXL1 (83%), SRSF2 (68%), and SETBP1 (58%). Mutations in SETBP1, SRSF2, TET2 , and GATA2 tended to appear within dominant clones, with frequent SRSF2 and SETBP1 codominance, while other RAS pathway mutations were more likely to appear as minor clones. Acquisition of new, previously undetectable mutations at transformation was observed in 63% of evaluable patients, the most common involving signaling pathway mutations. Hypomethylating agents were associated with the highest response rates and duration. With a median overall survival of 25 months (95% CI 20-30), intensive chemotherapy was associated with worse OS than other treatment modalities, and allogeneic stem cell transplantation was the only therapy associated with improved outcomes (HR 0.044, 95% CI 0.035-0.593, p=0.007). Age, platelet count, BM blast percentage, and serum LDH levels were independent predictors of survival and were integrated in a multivariable model which allowed to predict 1-year and 3-year survival.