Abstract Age-dependent differences in the clinical response to SARS-CoV-2 infection is well-documented 1–3 however the underlying molecular mechanisms involved are poorly understood. We infected fully differentiated human nasal epithelium cultures derived from healthy children (1-12 years old), young adults (26-34 years old) and older adults (56-62 years old) with SARS-COV-2 to identify age-related cell-intrinsic differences that may influence viral entry, replication and host defence response. We integrated imaging, transcriptomics, proteomics and biochemical assays revealing age-related changes in transcriptional regulation that impact viral replication, effectiveness of host responses and therapeutic drug targets. Viral load was lowest in infected older adult cultures despite the highest expression of SARS-CoV-2 entry and detection factors. We showed this was likely due to lower expression of hijacked host machinery essential for viral replication. Unlike the nasal epithelium of young adults and children, global host response and induction of the interferon signalling was profoundly impaired in older adults, which preferentially expressed proinflammatory cytokines mirroring the “cytokine storm” seen in severe COVID-19 4,5 . In silico screening of our virus-host-drug network identified drug classes with higher efficacy in older adults. Collectively, our data suggests that cellular alterations that occur during ageing impact the ability for the host nasal epithelium to respond to SARS-CoV-2 infection which could guide future therapeutic strategies.

Abstract Background Aggressive primary brain tumors such as glioblastoma are uniquely challenging to treat. The intracranial location poses barriers to therapy, and the potential for severe toxicity. Effective treatments for primary brain tumors are limited, and 5-year survival rates remain poor. Immune checkpoint inhibitor therapy has transformed treatment of some other cancers but has yet to significantly benefit patients with glioblastoma. Early phase trials of CAR-T cell therapy have demonstrated that this approach is safe and feasible, but with limited evidence of its effectiveness. The choices of appropriate target antigens for CAR-T cell therapy also remain limited. Methods We profiled an extensive biobank of patients’ biopsy tissues and patient-derived early passage glioma neural stem cell lines for GD2 expression using immunomicroscopy and flow cytometry. We then employed an approved clinical manufacturing process to make CAR-T cells from peripheral blood of glioblastoma and diffuse midline glioma patients and characterized their phenotype and function in vitro . Finally, we tested intravenously administered CAR-T cells in an aggressive intracranial xenograft model of glioblastoma and used multicolor flow cytometry, multicolor whole-tissue immunofluorescence and next-generation RNA sequencing to uncover markers associated with effective tumor control. Results Here we show that the tumor-associated antigen GD2 is highly and consistently expressed in primary glioblastoma tissue removed at surgery. Moreover, despite glioblastoma patients having perturbations in their immune system, highly functional GD2-specific CAR-T cells can be produced from their peripheral T cells using an approved clinical manufacturing process. Finally, after intravenous administration, GD2-CAR-T cells effectively infiltrated the brain and controlled tumor growth in an aggressive orthotopic xenograft model of glioblastoma. Tumor control was further improved using CAR-T cells manufactured with a clinical retroviral vector encoding an IL-15 transgene alongside the GD2-specific CAR. These CAR-T cells achieved a striking 50% complete response rate by bioluminescence imaging in established intracranial tumors. Markers associated with tumor control included those related to T-cell homing, infiltration, and cytotoxicity. Conclusions Targeting GD2 using a clinically deployed CAR-T therapy has a sound scientific and clinical rationale as a treatment for glioblastoma and other aggressive primary brain tumors. What is already known on this topic GD2 is a tumor antigen of significant interest for targeting immunotherapy. A single preclinical study has shown the effectiveness of GD2-CAR-T cell therapy in an orthotopic xenograft model of diffuse midline glioma. Similarly, there is one previous preclinical study of GD2-CAR-T therapy in a orthotopic glioblastoma xenograft model but tumor control was achieved only following intracranial injection of CAR-T cells. Given that GD2-CAR-T therapy is already being evaluated clinically for other tumor indications, it is important to establish whether there is an acceptable rationale for its use in brain tumors. What this study adds This is the first description of a GD2-targeted CAR-T cell therapy that shows antitumor effectiveness in a preclinical model of human glioblastoma following intravenous administration. It is also the first study to investigate the potential effects that the immune profile of glioblastoma patients may have on the feasibility of CAR-T cell manufacturing. How this study might affect research, practice, or policy The results of this study have led to the initiation of an Australian phase 1 clinical trial program aiming to test GD2-specific CAR-T cells for the treatment of childhood and adult primary brain tumors. The study provides valuable insights into the microenvironmental factors that influence the effectiveness of CAR-T cell therapy for this type of tumor, paving the way for further optimization of CAR-T cell technology for treatment of aggressive primary brain tumors such as glioblastoma.

Abstract Molecular profiling of the tumour immune microenvironment (TIME) has enabled the rational choice of immunotherapies in some adult cancers. In contrast, the TIME of paediatric cancers is relatively unexplored. We speculated that a more refined appreciation of the TIME in childhood cancers, rather than a reliance on commonly used biomarkers such as tumour mutation burden (TMB), neoantigen load and PD-L1 expression, is an essential prerequisite for improved immunotherapies in childhood solid cancers. We combined immunohistochemistry (IHC) and molecular profiling to develop an alternative, expression-based signature associated with CD8 + T-cell infiltration of the TIME in high-risk paediatric tumours. Using this novel 15-gene immune signature, Immune Paediatric Signature Score (IPASS), we estimate up to 31% of high-risk cancers harbour infiltrating T-cells. Our data provides new insights into the variable immune-suppressive mechanisms dampening responses in paediatric solid cancers. Effective immune-based interventions in high-risk paediatric cancer will require individualised analysis of the TIME.

Abstract Encapsulins, self-assembling protein nanocages derived from prokaryotes, are promising nanoparticle-based drug delivery systems (NDDS). However, the in vivo behavior and fate of encapsulins are poorly understood. In this pre-clinical study, we probe the interactions between the model encapsulin from Thermotoga maritima (TmEnc) and key biological barriers encountered by NDDS. Here, a purified TmEnc formulation that exhibited colloidal stability, storability, and blood compatibility was intravenously injected into BALB/c mice. TmEnc had an excellent nanosafety profile, with no abnormal weight loss or gross pathology observed, and only temporary alterations in toxicity biomarkers detected. Notably, TmEnc demonstrated immunogenic properties, inducing the generation of nanocage-specific IgM and IgG antibodies, but without any prolonged pro-inflammatory effects. An absence of antibody cross-reactivity also suggested immune-orthogonality among encapsulins systems. Moreover, TmEnc formed a serum-derived protein corona on its surface which changed dynamically and appeared to play a role in immune recognition. TmEnc’s biodistribution profile further revealed its sequestration from the blood circulation by the liver and then biodegraded within Kupffer cells, thus indicating clearance via the mononuclear phagocyte system. Collectively, these findings provide critical insights into how encapsulins behave in vivo, thereby informing their future design, modification, and application in targeted drug delivery.

Abstract Copper is a trace element essential to cellular function with elevated levels implicated in cancer progression. Clinical trials using copper chelators are associated with improved patient survival, however, the molecular mechanisms by which copper depletion inhibits tumor progression are poorly understood. This remains a major hurdle to the clinical translation of copper chelators. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) is often exploited by malignant cells to promote growth and metastasis. Transforming growth factor (TGF)- β is a master regulator of EMT and facilitates cancer progression through changes in the tumor and its microenvironment. Herein, we report that a reduction of copper with the chelating agent tetraethylenepentamine (TEPA) inhibited EMT in vitro in three diverse cancer cell types; human triple-negative breast cancer (TNBC), neuroblastoma (NB), and diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG) cell lines. Single-molecule imaging demonstrated EMT markers including Vimentin, β -catenin, ZEB1, and p-SMAD2 had increased expression with copper treatment and this pro-mesenchymal shift was rescued by the addition of TEPA. Moreover, SNAI1, ZEB1, and p-SMAD2 demonstrated increased accumulation in the cytoplasm after treating with TEPA. Transcriptomic analyses revealed a significant downregulation of the EMT pathway, including canonical (TGF- β /SMAD2&3) and non-canonical (TGF- β /PI3K/AKT and TGF- β /RAS/RAF/MEK/ERK) TGF signaling pathways. Matrix metalloproteinases MMP-9 and MMP-14 proteins which activate latent TGF- β complexes were also downregulated by TEPA treatment. These molecular changes are consistent with reduced plasma levels of TGF- β we observed in cancer models treated with TEPA. Importantly, copper chelation reduced metastasis to the lung in a TNBC orthotopic syngeneic mouse model. Our studies suggest copper chelation therapy can be used to inhibit EMT-induced metastasis by targeting TGF- β signalling. Because on-target anti-TGF- β therapies are failing in the clinic, copper chelation presents itself as a potential therapy for targeting TGF- β in cancer.

Copper participates in a range of critical functions in the nervous system and human brain. Disturbances in brain copper content is strongly associated with neurological diseases. For example, changes in the level and distribution of copper are reported in neuroblastoma, Alzheimer's disease, and Lewy body disorders, such as Parkinson disease and dementia with Lewy bodies (DLB). There is a need for more sensitive techniques to measure intracellular copper levels to have a better understanding of the role of copper homeostasis in neuronal disorders. Here, we report a reaction-based near-infrared (NIR) ratiometric fluorescent probe