Abstract Mitoribosomes consist of ribosomal RNA and protein components, coordinated assembly of which is critical for function. We used mitoribosomes with reduced RNA and increased protein mass from Trypanosoma brucei , to provide insights into the biogenesis of mitoribosomal large subunit. Structural characterisation of a stable assembly intermediate revealed 22 assembly factors, some of which are also encoded in mammalian genomes. The assembly factors form a protein network that spans over 180 Å, shielding the ribosomal RNA surface. The entire central protuberance and L7/L12 stalk are not assembled, and require removal of the factors and remodeling of the mitoribosomal proteins to become functional. The conserved proteins GTPBP7 and mt-EngA are bound together at the subunit interface in proximity to the peptidyl transferase center. A mitochondrial acyl-carrier protein plays a role in docking the L1 stalk which needs to be repositioned during maturation. Additional enzymatically deactivated factors scaffold the assembly, while the exit tunnel is blocked. Together, the extensive network of the factors stabilizes the immature sites and connects the functionally important regions of the mitoribosomal large subunit.

Abstract Mitochondrial ATP synthase forms stable dimers arranged into oligomeric assemblies that generate the inner-membrane curvature essential for efficient energy conversion. Here, we report cryo-EM structures of the intact ATP synthase dimer from Trypanosoma brucei in ten different rotational states. The model consists of 25 subunits, including nine lineage-specific, as well as 36 lipids. The rotary mechanism is influenced by the divergent peripheral stalk, conferring a greater conformational flexibility. Proton transfer in the lumenal half-channel occurs via a chain of five ordered water molecules. The dimerization interface is formed by subunit- g that is critical for interactions but not for the catalytic activity. Although overall dimer architecture varies among eukaryotes, we find that subunit- g together with subunit- e form an ancestral oligomerization motif, which is shared between the trypanosomal and mammalian lineages. Therefore, our data defines the subunit- g/e module as a structural component determining ATP synthase oligomeric assemblies.

Abstract Cardiolipin (CL) is a mitochondrial inner membrane glycerophospholipid that associates with mitochondrial proteins to promote their activities and to facilitate protein complex and super-complex formation. Loss of CL leads to destabilized respiratory complexes and mitochondrial dysfunction. The role of CL in an organism lacking a conventional electron transport chain (ETC) has not been elucidated so far. We now report that in Trypanosoma brucei bloodstream forms, in which the ETC is truncated and composed of alternative oxidase and glycerol-3-phosphate dehydrogenase, and the mitochondrial membrane potential is generated by the hydrolytic action of the F o F 1 -ATP synthase, the inducible depletion of cardiolipin synthase (TbCls) is essential for parasite survival. Loss of TbCls and CL caused a rapid drop in ATP levels and a decline in the mitochondrial membrane potential. Unbiased proteomic analyses revealed a reduction in the levels of many mitochondrial proteins, most notably of F o F 1 -ATP synthase subunits and of the alternative oxidase, resulting in a strong decline of glycerol-3-phosphate-stimulated oxygen consumption. Interestingly, the changes in cellular respiration preceded the observed decrease in F o F 1 -ATPase stability, suggesting that the truncated ETC is the first pathway responding to the decline in CL. In addition, proteomic and metabolomic analyses revealed that select proteins and pathways involved in glucose and amino acid transport and metabolism are up-regulated during CL depletion, possibly as a stress response to restore cellular ATP levels.

Abstract Trypanosoma brucei , a protist responsible for human African trypanosomiasis (sleeping sickness), is transmitted by the tsetse fly, where the procyclic forms of the parasite develop in the proline-rich (1-2 mM) and glucose-depleted digestive tract. Proline is essential for the midgut colonization of the parasite in the insect vector, however other carbon sources could be available and used to feed its central metabolism. Here we show that procyclic trypanosomes can consume and metabolize metabolic intermediates, including those excreted from glucose catabolism (succinate, alanine and pyruvate), with the exception of acetate, which is the ultimate end-product excreted by the parasite. Among the tested metabolites, tricarboxylic acid (TCA) cycle intermediates (succinate, malate and α-ketoglutarate) stimulated growth of the parasite in the presence of 2 mM proline. The pathways used for their metabolism were mapped by proton-NMR metabolic profiling and phenotypic analyses of a dozen RNAi and/or null mutants affecting central carbon metabolism. We showed that ( i ) malate is converted to succinate by both the reducing and oxidative branches of the TCA cycle, which demonstrates that procyclic trypanosomes can use the full TCA cycle, ( ii ) the enormous rate of α-ketoglutarate consumption (15-times higher than glucose) is possible thanks to the balanced production and consumption of NADH at the substrate level and ( iii ) α-ketoglutarate is toxic for trypanosomes if not appropriately metabolized as observed for an α-ketoglutarate dehydrogenase null mutant. In addition, epimastigotes produced from procyclics upon overexpression of RBP6, showed a growth defect in the presence of 2 mM proline, which is rescued by α-ketoglutarate, suggesting that physiological amounts of proline are not sufficient per se for the development of trypanosomes in the fly. In conclusion, these data show that trypanosomes can metabolize multiple metabolites, in addition to proline, which allows them to confront challenging environments in the fly. Author Summary In the midgut of its insect vector, trypanosomes rely on proline to feed their energy metabolism. However, the availability of other potential carbon sources that can be used by the parasite is currently unknown. Here we show that tricarboxylic acid (TCA) cycle intermediates, i.e. succinate, malate and α-ketoglutarate, stimulate growth of procyclic trypanosomes incubated in medium containing 2 mM proline, which is in the range of the amounts measured in the midgut of the fly. Some of these additional carbon sources are needed for the development of epimastigotes, which differentiate from procyclics in the midgut of the fly, since their growth defect observed in the presence of 2 mM proline is rescued by addition of α-ketoglutarate. In addition, we have implemented new approaches to study a poorly explored branch of the TCA cycle converting malate to α-ketoglutarate, which was previously described as non-functional in the parasite, regardless of the glucose levels available. The discovery of this branch reveals that a full TCA cycle can operate in procyclic trypanosomes. Our data broaden the metabolic potential of trypanosomes and pave the way for a better understanding of the parasite’s metabolism in various organ systems of the tsetse fly, where it evolves.

Abstract The bloodstream form Trypanosoma brucei maintains essential mitochondrial membrane potential (ΔΨm) through the reverse activity of FoF1-ATP synthase. The ATP that drives this activity is thought to be generated by glycolysis and imported from the cytosol via an ATP/ADP carrier (AAC). We have shown that this carrier is the only carrier that can import ATP into the mitochondrial matrix to power the F o F 1 -ATPase. Contrary to expectations, its deletion has no effect on parasite growth, virulence and levels of ΔΨm, suggesting that ATP is produced intramitochondrially by substrate phosphorylation pathways. Therefore, we knocked out the succinyl-CoA synthetase (SCoAS) gene, a key enzyme that produces ATP through substrate phosphorylation. Its absence resulted in changes in the metabolic landscape of the parasite, lower virulence, and reduced mitochondrial ATP content. This minimal mitochondrial ATP pool was maintained by AAC activity as evidenced by the 25- fold increase in sensitivity of the mutant parasites to AAC inhibitor carboxyatractyloside. Under nutrient-limited conditions, suppression of SCoAS expression by RNA interference negatively affected cell growth and levels of ΔΨm. We concluded that the bloodstream mitochondrion is capable of generating ATP via substrate phosphorylation pathways, the importance of which depends on environmental conditions.

Abstract The passage of protons across membranes through F 1 F o -ATP synthases spins their rotors and drives synthesis of ATP. While the principle of torque generation by proton transfer is known, the mechanisms and routes of proton access and release and their evolution are not fully understood. Here, we show that the entry site and path of protons in the lumenal half-channel of mitochondrial ATP synthases are largely defined by a short N-terminal α-helix of subunit-a. In Trypanosoma brucei and other Euglenozoa, the α-helix is part of another polypeptide chain that is a product of subunit-a gene fragmentation. This α-helix and other elements forming the proton pathway are widely conserved across eukaryotes and in Alphaproteobacteria, the closest extant relatives of mitochondria, but not in other bacteria. The α-helix blocks one of two proton routes found in Escherichia coli , resulting in the single proton entry site in mitochondrial and alphaproteobacterial ATP synthases. Thus, the shape of the access half-channel predates eukaryotes and originated in the lineage from which mitochondria evolved by endosymbiosis.

Abstract Mitochondrial cristae are polymorphic invaginations of the inner membrane that are the fabric of cellular respiration. Both the Mitochondrial Contact Site and Cristae Organization System (MICOS) and the F O F 1 -ATP synthase are vital for sculpting cristae by opposing membrane bending forces. While MICOS promotes negative curvature at cristae junctions, dimeric F O F 1 - ATP synthase is crucial for positive curvature at cristae rims. Crosstalk between these two complexes has been observed in baker’s yeast, the model organism of the Opisthokonta supergroup. Here, we report that this property is conserved in Trypanosoma brucei , a member of the Discoba supergroup that separated from Opisthokonta ∼2 billion years ago. Specifically, one of the paralogs of the core MICOS subunit Mic10 interacts with dimeric F 1 F O -ATP synthase, whereas the other core Mic60 subunit has a counteractive effect on F 1 F O - ATP synthase oligomerization. This is evocative of the nature of MICOS-F 1 F O -ATP synthase crosstalk in yeast, which is remarkable given the diversification these two complexes have undergone during almost 2 eons of independent evolution. Furthermore, we identified a highly diverged trypanosome homolog of subunit e, which is essential for the stability of F 1 F O -ATP synthase dimers in yeast. Just like subunit e, it is preferentially associated with dimers, interacts with Mic10 and its silencing results in severe defects to cristae and disintegration of F 1 F O -ATP synthase dimers. Our findings indicate that crosstalk between MICOS and dimeric F 1 F O -ATP synthase is a fundamental property impacting cristae shape throughout eukaryotes. Importance Mitochondria have undergone profound diversification in separate lineages that have radiated since the last common ancestor of eukaryotes some eons ago. Most eukaryotes are unicellular protists, including etiological agents of infectious diseases like Trypanosoma brucei . Thus, the study of a broad range of protists can reveal fundamental features shared by all eukaryotes and lineage-specific innovations. Here we report that two different protein complexes, MICOS and F 1 F O -ATP synthase, known to affect mitochondrial architecture, undergo crosstalk in T. brucei , just as in baker’s yeast. This is remarkable considering that these complexes have otherwise undergone many changes during their almost two billion years of independent evolution. Thus, this crosstalk is a fundamental property needed to maintain proper mitochondrial structure even if the constituent players considerably diverged.

Abstract Many of the currently available anti-parasitic and anti-fungal frontline drugs have severe limitations, including adverse side effects, complex administration, and increasing occurrence of resistance. The discovery and development of new therapeutic agents is a costly and lengthy process. Therefore, repurposing drugs with already established clinical application offers an attractive, fast-track approach for novel treatment options. In this study, we show that the anti-cancer drug MitoTam, a mitochondria-targeted analog of tamoxifen, efficiently eliminates a wide range of evolutionarily distinct pathogens in vitro , including pathogenic fungi, Plasmodium falciparum , and several species of trypanosomatid parasites, causative agents of debilitating neglected tropical diseases. MitoTam treatment was also effective in vivo and significantly reduced parasitemia of two medically important parasites, Leishmania mexicana and Trypanosoma brucei , in their respective animal infection models. Functional analysis in the bloodstream form of T. brucei showed that MitoTam rapidly altered mitochondrial functions, particularly affecting cellular respiration, lowering ATP levels, and dissipating mitochondrial membrane potential. Our data suggest that the mode of action of MitoTam involves disruption of the inner mitochondrial membrane, leading to rapid organelle depolarization and cell death. Altogether, MitoTam is an excellent candidate drug against several important pathogens, for which there are no efficient therapies and for which drug development is not a priority. Author Summary MitoTam, a mitochondrially targeted analog of tamoxifen, is a promising anti-cancer candidate drug acting by accumulating in and destabilizing cell mitochondria. In this study, we analyze its effect on a wide range of evolutionarily distinct and medically important pathogens. These include a) pathogenic fungi, Candida albicans, and Cryptococcus neoformans, ubiquitous opportunistic pathogens that cause life-threatening diseases in immunocompromised or immunologically deficient individuals; b) Plasmodium falciparum , the causative agent of human malaria; and c) several species of trypanosomatid parasites such as Trypanosoma cruzi, responsible for deadly Chagas disease in South America, Trypanosoma brucei, the causative agent of sleeping sickness in Africa, and Leishmania, the etiological agent of leishmaniasis, a spectrum of diseases ranging from usually self-healing but potentially disfiguring cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis, to visceral leishmaniasis, which is invariably fatal if left untreated. We show that MitoTam efficiently kills these parasites in laboratory conditions and in the case of trypanosomes and leishmaniases suppress or at least slow down the infection in mouse model.

Abstract Trypanosoma brucei is a causative agent of the Human and Animal African Trypanosomiases. The mammalian stage parasites infect various tissues and organs including the bloodstream, central nervous system, skin, adipose tissue and lungs. They rely on ATP produced in glycolysis, consuming large amounts of glucose, which is readily available in the mammalian host. In addition to glucose, glycerol can also be used as a source of carbon and ATP and as a substrate for gluconeogenesis. However, the physiological relevance of glycerol-fed gluconeogenesis for the mammalian-infective life cycle forms remains elusive. To demonstrate its (in)dispensability, first we must identify the enzyme(s) of the pathway. Loss of the canonical gluconeogenic enzyme, fructose-1,6-bisphosphatase, does not abolish the process hence at least one other enzyme must participate in gluconeogenesis in trypanosomes. Using a combination of CRISPR/Cas9 gene editing and RNA interference, we generated mutants for four enzymes potentially capable of contributing to gluconeogenesis: fructose-1,6-bisphoshatase, sedoheptulose-1,7-bisphosphatase, phosphofructokinase and transaldolase, alone or in various combinations. Metabolomic analyses revealed that flux through gluconeogenesis was maintained irrespective of which of these genes were lost. Our data render unlikely a previously hypothesised role of a reverse phosphofructokinase reaction in gluconeogenesis and preclude the participation of a novel biochemical pathway involving transaldolase in the process. The sustained metabolic flux in gluconeogenesis in our mutants, including a triple-null strain, indicates the presence of a unique enzyme participating in gluconeogenesis. Additionally, the data provide new insights into gluconeogenesis and the pentose phosphate pathway, and improve the current understanding of carbon metabolism of the mammalian-infective stages of T. brucei . Author Summary Trypanosoma brucei is a unicellular parasite causing sleeping sickness in humans and nagana disease in cattle. The parasite invades the bloodstream and cerebrospinal fluid and only recently, it has been shown to infect additional tissues such as skin, adipose tissue, or lungs. While the glucose-based metabolism of the bloodstream form is well understood, the parasite’s metabolism in these secondary tissues has not been sufficiently explored, despite its importance for drug development. One possibility is the use of gluconeogenesis since the mammalian-infective stages can use glycerol as a carbon and ATP source. First, enzymes involved in gluconeogenesis have to be identified, then it can be tested if the pathway is advantageous for the survival of the parasite. We generated mutants in four different enzymes potentially involved in this metabolic pathway. Surprisingly, the flux in gluconeogenesis was maintained in all cell lines tested, implying that another non-canonical enzyme participates in the production of glucose from glycerol in these parasites.