Chromosome segregation errors during cell divisions generate aneuploidies and micronuclei, which can undergo extensive chromosomal rearrangements such as chromothripsis1-5. Selective pressures then shape distinct aneuploidy and rearrangement patterns-for example, in cancer6,7-but it is unknown whether initial biases in segregation errors and micronucleation exist for particular chromosomes. Using single-cell DNA sequencing8 after an error-prone mitosis in untransformed, diploid cell lines and organoids, we show that chromosomes have different segregation error frequencies that result in non-random aneuploidy landscapes. Isolation and sequencing of single micronuclei from these cells showed that mis-segregating chromosomes frequently also preferentially become entrapped in micronuclei. A similar bias was found in naturally occurring micronuclei of two cancer cell lines. We find that segregation error frequencies of individual chromosomes correlate with their location in the interphase nucleus, and show that this is highest for peripheral chromosomes behind spindle poles. Randomization of chromosome positions, Cas9-mediated live tracking and forced repositioning of individual chromosomes showed that a greater distance from the nuclear centre directly increases the propensity to mis-segregate. Accordingly, chromothripsis in cancer genomes9 and aneuploidies in early development10 occur more frequently for larger chromosomes, which are preferentially located near the nuclear periphery. Our findings reveal a direct link between nuclear chromosome positions, segregation error frequencies and micronucleus content, with implications for our understanding of tumour genome evolution and the origins of specific aneuploidies during development.

The regulation of gene expression is governed at multiple levels of chromatin organization. However, how coordination is achieved remains relatively unexplored. Here we present Dam&ChIC, a method that enables time-resolved and multifactorial chromatin profiling at high resolution in single cells. Analysis of genome-lamina interactions in haploid cells reveals highly dynamic spatial repositioning of small domains during interphase and partial inheritance over mitosis. Dam&ChIC applied to study random X-inactivation uncovers that spreading of H3K27me3 on the inactive X chromosome (Xi) overlaps with remarkable genome-lamina detachment. We find that genome-lamina detachment precedes H3K27me3 accumulation on the Xi and occurs upon mitotic exit. Domains that retain genome-lamina interactions are marked by high pre-existing H3K9me3 levels. These findings imply an important role for genome-lamina interactions in regulating H3K27me3 accumulation on the Xi. We anticipate that Dam&ChIC will be instrumental in unraveling the interconnectivity and order of chromatin events underlying cell-state changes in single cells.

Gene expression programs result from the collective activity of many regulatory factors. To obtain insight into the mechanisms that govern gene regulation, it is imperative to study their combined mode of action and interconnectivity. However, it has been challenging to simultaneously measure a combination of these factors within one sample. Here, we introduce MAbID, a method that combines genomic profiling of many histone modifications and chromatin-binding proteins in a single reaction. MAbID employs antibody-DNA conjugates to enable genomic barcoding of chromatin at sites of epitope occupancy. This barcoding strategy allows for the combined incubation of multiple antibodies in a single sample to reveal the genomic distributions of many epigenetic states simultaneously. We used MAbID to profile both active and inactive chromatin types in human cell lines and multiplexed measurements in the same sample without loss of data quality. Moreover, we obtained joint measurements of six epitopes covering all major chromatin types in single cells during mouse in vitro neural differentiation and captured associated changes in multifactorial chromatin states. Thus, MAbID holds the potential to gain unique insights into the interplay between gene regulatory mechanisms, especially in settings with limited sample material and in single cells.

Abstract Accurate repair of DNA damage is critical for maintenance of genomic integrity and cellular survival. Because damage occurs non-uniformly across the genome, single-cell resolution is required for proper interrogation, but sensitive detection has remained challenging. Here, we present genome-wide binding profiles of DNA double-strand break repair proteins in single cells, allowing for the study of heterogeneity in genomic damage locations and associated repair features. By unbiasedly detecting repair-enriched segments, we find that repair proteins often occupy entire topologically associating domains and mimic variability in chromatin loop anchoring. Genomic loci that form damage-specific 3D contacts show multi-way repair coordination in individual cells that becomes stronger according to the number of interaction partners. These findings advance our understanding of genome stability in the context of nuclear organization.

Abstract Recent advances in single-cell sequencing technologies have enabled simultaneous measurement of multiple cellular modalities, including various combinations of transcriptome, genome and epigenome. However, comprehensive profiling of the histone post-translational modifications that influence gene expression at single-cell resolution has remained limited. Here, we introduce EpiDamID, an experimental approach to target a diverse set of chromatin types by leveraging the binding specificities of genetically engineered proteins. By fusing Dam to single-chain variable fragment antibodies, engineered chromatin reader domains, or endogenous chromatin-binding proteins, we render the DamID technology and all its implementations compatible with the genome-wide identification of histone post-translational modifications. Importantly, this enables the joint analysis of chromatin marks and transcriptome in a variety of biological systems at the single-cell level. In this study, we use EpiDamID to profile single-cell Polycomb occupancy in mouse embryoid bodies and provide evidence for hierarchical gene regulatory networks. We further demonstrate the applicability of this method to in vivo systems by mapping H3K9me3 in early zebrafish embryogenesis, and detect striking heterochromatic regions specifically in the notochord. Overall, EpiDamID is a new addition to a vast existing toolbox for obtaining systematic insights into the role of chromatin states during dynamic cellular processes.

Accurate repair of DNA damage is critical for maintenance of genomic integrity and cellular viability. Because damage occurs non-uniformly across the genome, single-cell resolution is required for proper interrogation, but sensitive detection has remained challenging. Here, we present a comprehensive analysis of repair protein localization in single human cells using DamID and ChIC sequencing techniques. This study reports genome-wide binding profiles in response to DNA double-strand breaks induced by AsiSI, and explores variability in genomic damage locations and associated repair features in the context of spatial genome organization. By unbiasedly detecting repair factor localization, we find that repair proteins often occupy entire topologically associating domains, mimicking variability in chromatin loop anchoring. Moreover, we demonstrate the formation of multi-way chromatin hubs in response to DNA damage. Notably, larger hubs show increased coordination of repair protein binding, suggesting a preference for cooperative repair mechanisms. Together, our work offers insights into the heterogeneous processes underlying genome stability in single cells. Accurate repair of DNA damage is crucial for genome stability and preventing disease. Here, the authors adapt single-cell omics technologies to map the location of repair proteins across the human genome, showing formation of multi-way chromatin hubs in response to damage.