Abstract Subterranean habitats are generally very stable environments, and as such evolutionary transitions of organisms from surface to subterranean lifestyles may cause considerable shifts in physiology, particularly with respect to thermal tolerance. In this study we compared responses to heat shock at the molecular level in a geographically widespread, surface-dwelling water beetle to a congeneric subterranean species restricted to a single aquifer (Dytiscidae: Hydroporinae). The obligate subterranean beetle Paroster macrosturtensis is known to have a lower thermal tolerance compared to surface lineages (CT max 38°C cf . 42-46 °C), but the genetic basis of this physiological difference has not been characterized. We experimentally manipulated the thermal environment of 24 individuals to demonstrate that both species can mount a heat shock response at high temperatures (35°C), as determined by comparative transcriptomics. However, genes involved in these responses differ between species and a far greater number were differentially expressed in the surface taxon, suggesting it can mount a more robust heat shock response; these data may underpin its higher thermal tolerance compared to subterranean relatives. In contrast, the subterranean species examined not only differentially expressed fewer genes in response to increasing temperatures, but also in the presence of the experimental setup employed here alone. Our results suggest P. macrosturtensis may be comparatively poorly equipped to respond to both thermally induced stress and environmental disturbances more broadly. The molecular findings presented here have conservation implications for P. macrosturtensis and contribute to a growing narrative concerning weakened thermal tolerances in obligate subterranean organisms at the molecular level.

Abstract The COVID-19 pandemic has necessitated the rapid development and implementation of whole genome sequencing (WGS) and bioinformatic methods for managing the pandemic. However, variability in methods and capabilities between laboratories has posed challenges in ensuring data accuracy. A national working group comprising 18 laboratory scientists and bioinformaticians from Australia and New Zealand was formed to improve data concordance across public health laboratories (PHLs). One effort, presented in this study, sought to understand the impact of methodology on consensus genome concordance and interpretation. Data were retrospectively obtained from the 2021 Royal College of Pathologists of Australasia Quality Assurance Programs (RCPAQAP) SARS-CoV-2 WGS proficiency testing program (PTP), which included 11 participating Australian laboratories. The submitted consensus genomes and reads from eight contrived specimen were investigated, focusing on discordant sequence data, and findings were presented to the working group to inform best practices. Despite using a variety of laboratory and bioinformatic methods for SARS-CoV-2 WGS, participants largely produced concordant genomes. Two participants returned five discordant sites in a high Ct replicate which could be resolved with reasonable bioinformatic quality thresholds. We noted ten discrepancies in genome assessment that arose from nucleotide heterogeneity at three different sites in three cell-culture derived control specimen. While these sites were ultimately accurate after considering the participants’ bioinformatic parameters, it presented an interesting challenge for developing standards to account for intrahost single nucleotide variation (iSNV). Observed differences had little to no impact on key surveillance metrics, lineage assignment and phylogenetic clustering, while genome coverage <90% affected both. We recommend PHLs bioinformatically generate two consensus genomes with and without ambiguity thresholds for quality control and downstream analysis, respectively, and adhere to a minimum 90% genome coverage threshold for inclusion in surveillance interpretations. We also suggest additional PTP assessment criteria, including primer efficiency, detection of iSNVs, and minimum genome coverage of 90%. This study underscores the importance of multidisciplinary national working groups in informing guidelines in real time for bioinformatic quality acceptance criteria. It demonstrates the potential for enhancing public health responses through improved data concordance and quality control in SARS-CoV-2 genomic analysis during pandemic surveillance. Data summary The authors confirm all supporting data, code and protocols have been provided within the article or through supplementary data files. Impact statement Amidst the COVID-19 pandemic, a unique collaboration between a national multidisciplinary working group and a quality assurance program facilitated ongoing development of standardized quality control criteria and analysis methods for high-quality SARS-CoV-2 genomic approaches across Australia. With this article, we shed light on the robustness of amplicon sequencing and analysis methods to produce highly concordant genomes, while also presenting additional assessment criteria to guide laboratories in identifying areas for improvement. Insights from this nationwide collaboration underscore the need for real-time knowledge-sharing and iterative refinements to quality standards, particularly as situations and methods evolve during a pandemic. While the spotlight is on SARS-CoV-2, the analyses and findings have universal implications for genomic surveillance during infectious disease outbreaks. As WGS becomes increasingly central in outbreak surveillance, continuous evaluation and collaboration, like that described here, are vital to ensure data accuracy and inform future public health responses.

Evolution leaves heterogeneous patterns of nucleotide variation across the genome, with different loci subject to varying degrees of mutation, selection, and drift. Appropriately modelling this heterogeneity is important for reliable phylogenetic inference. One modelling approach in statistical phylogenetics is to apply independent models of molecular evolution to different groups of sites, where the groups are usually defined by locus, codon position, or combinations of the two. The potential impacts of partitioning data for the assignment of substitution models are well appreciated. Meanwhile, the treatment of branch lengths has received far less attention. In this study, we examined the effects of linking and unlinking branch-length parameters across loci. By analysing a range of empirical data sets, we find that the best-fitting model for phylogenetic inference is consistently one in which branch lengths are proportionally linked: gene trees have the same pattern of branch-length variation, but with varying absolute tree lengths. This model provided a substantially better fit than those that either assumed identical branch lengths across gene trees or that allowed each gene tree to have its own distinct set of branch lengths. Using simulations, we show that the fit of the three different models of branch lengths varies with the length of the sequence alignment and with the number of taxa in the data set. Our findings suggest that a model with proportionally linked branch lengths across loci is likely to provide the best fit under the conditions that are most commonly seen in practice. In future work, improvements in fit might be afforded by models with levels of complexity intermediate to proportional and free branch lengths. The results of our study have implications for model selection, computational efficiency, and experimental design in phylogenomics.

Microbial symbioses have had profound impacts on the evolution of animals. Conversely, changes in host biology may impact the evolutionary trajectory of symbionts themselves. Blattabacterium cuenoti is present in almost all cockroach species and enables hosts to subsist on a nutrient-poor diet. To investigate if host biology has impacted Blattabacterium at the genomic level, we sequenced and analysed 25 genomes from Australian soil-burrowing cockroaches (Blaberidae: Panesthiinae) which have undergone at least seven independent subterranean transitions from above-ground, wood-feeding ancestors. We find at least three independent instances of genome erosion have occurred in Blattabacterium strains exclusive to Australian soil-burrowing cockroaches. Such shrinkages have involved the repeated inactivation of genes involved in amino acid biosynthesis and nitrogen recycling, the core role of Blattabacterium in the host-symbiont relationship. The most drastic of these erosions have occurred in hosts thought to have transitioned underground the earliest relative to other lineages. As Blattabacterium is unable to fulfil its core function in such host groups, our findings suggest soil-burrowing cockroaches must acquire these nutrients from novel sources. Our study represents one of the first cases, to our knowledge, of parallel host adaptations leading to concomitant parallelism in their mutualistic symbionts, further underscoring the intimate relationship between these two partners.

Evolutionary timescales can be inferred from molecular sequence data using a Bayesian phylogenetic approach. In these methods, the molecular clock is often calibrated using fossil data. The uncertainty in these fossil calibrations is important because it determines the limiting posterior distribution for divergence-time estimates as the sequence length tends to infinity. Here we investigate how the accuracy and precision of Bayesian divergence-time estimates improve with the increased clock-partitioning of genome-scale data into clock-subsets. We focus on a data set comprising plastome-scale sequences of 52 angiosperm taxa. There was little difference among the Bayesian date estimates whether we chose clock-subsets based on patterns of among-lineage rate heterogeneity or relative rates across genes, or by random assignment. Increasing the degree of clock-partitioning usually led to an improvement in the precision of divergence-time estimates, but this increase was asymptotic to a limit presumably imposed by fossil calibrations. Our clock-partitioning approaches yielded highly precise age estimates for several key nodes in the angiosperm phylogeny. For example, when partitioning the data into 20 clock-subsets based on patterns of among-lineage rate heterogeneity, we inferred crown angiosperms to have arisen 198-178 Ma. This demonstrates that judicious clock-partitioning can improve the precision of molecular dating based on phylogenomic data, but the meaning of this increased precision should be considered critically.

Measures to control the COVID-19 pandemic such as antiviral therapy and vaccination have been challenged by ongoing virus evolution under antiviral and immune pressures. Understanding viral evolutionary dynamics is crucial for responding to SARS-CoV-2, and preparing for the next pandemic, by informing prediction of virus adaptation, public health strategies, and design of broadly effective therapies. Whole-genome sequencing (WGS) of SARS-CoV-2 during the pandemic enabled fine-grained studies of virus evolution in the human population. Serial passaging in vitro offers a controlled environment to investigate the emergence and persistence of genetic variants that may confer selective advantage. Nine virus lineages, including four "variants of concern" and three former "variants under investigation" as designated by the World Health Organisation, were chosen to investigate intra- and inter-lineage evolution through long-term serial passaging in Vero E6 cells. Viruses were sampled over at least 33 passages (range 33-100) and analysed using WGS to examine evolutionary dynamics and identify key mutations with implications for virus fitness, transmissibility, and immune evasion. All passages continued to replicate in culture, despite regular accumulation of mutations. There was evidence of convergent acquisition of mutations both across passage lines and compared with contemporaneous SARS CoV-2 clinical sequences from population studies. Some of these convergent mutations are hypothesised to be important in proliferation of SARS-CoV-2 lineages, such as by evading host immune responses (e.g. S:A67V, S:H655Y). Given these mutations arose in vitro, in the absence of a multicellular host immune response, this suggests virus genome mutation resulted from stochastic events, rather than immune-driven mutation. There was a regular gain and loss of low-frequency variants during serial passaging, but some became fixed in subsequent multiple passages, suggesting either a benefit of the mutation in vitro, or at least a lack of deleterious effect. Our findings reveal valuable insights into the evolution of SARS-CoV-2 by quantitatively investigating evolutionary dynamics of the virus over the greatest number of serial passages to date. Knowledge of these evolutionary trends will be useful for public health and the development of antiviral and vaccine measures to reduce the effects of SARS CoV-2 infection on the human population.

Since the first report of SARS-CoV-2 in December 2019, Taiwan has gone through three local outbreaks. Unlike the first two outbreaks, the spatial and temporal origin of the third outbreak (April 20 to November 5, 2021) is still unclear. We assembled and analyzed a data set of more than 6,000 SARS-CoV-2 genomes, including 300 from Taiwan and 5812 related sequences downloaded from GISAID as of 2021/12/08. We found that the third outbreak in Taiwan was caused by a single virus lineage belonging to Alpha (B.1.1.7) strain. This lineage, T-III (the third outbreak in Taiwan), carries a distinct genetic fingerprint, consisting of spike M1237I (S-M1237I) and three silent mutations, C5812T, C15895T, and T27869C. The T-III is closest to the sequences derived from Turkey on February 8, 2021. The estimated age of the most recent common ancestor (TMRCA) of T-III is March 23, 2021 (95% highest posterior density [HPD] February 24 - April 13, 2021), almost one month before the first three confirmed cases on April 20, 2021. The effective population size of the T-III showed approximately 20-fold increase after the onset of the outbreak and reached a plateau in early June 2021. Our results reconcile several unresolved observations, including the occurrence of two infection clusters at the same time without traceable connection and several airline pilots who were PCR negative but serum IgM-/IgG+ for SARS-CoV-2 in late April. Therefore, in contrast to the general notion that the third SARS-CoV-2 outbreak in Taiwan was sparked by two imported cases from USA on April 20, 2021, which, in turn, was caused by the partial relaxation of entry quarantine measures in early April 2021, our comprehensive analyses demonstrated that the outbreak was most likely originated from Europe in February 2021.