Most bacterial, plant and fungal cells possess at their surface a protective layer called the cell wall, conferring strength, plasticity and rigidity to withstand the osmotic pressure. This molecular barrier is crucial for pathogenic microorganisms, as it protects the cell from the local environment and often constitutes the first structural component encountered in the host-pathogen interaction. In pathogenic molds and yeasts, the cell wall constitutes the main target for the development of clinically-relevant antifungal drugs. In the past decade, solid-state NMR has emerged as a powerful analytical technique to investigate the molecular organization of microbial cell walls in the context of intact cells.

Abstract Spider silk is renowned for its exceptional mechanical properties, surpassing those of other natural and many synthetic fibers. Yet, replicating its remarkable properties through synthetic production remains a challenge. The variability in the mechanical properties of synthetic spider silks lacking protective coatings, exacerbated by factors such as spinning conditions and humidity levels, poses an additional challenge, impacting their application potential. Bioconjugation offers a versatile synthetic method to modify protein structures, enhancing their pharmacokinetics, solubility, stability, and immune response. In particular, polyethylene glycol (PEG)‐ylation has emerged as a successful strategy with numerous marketed PEG–protein conjugates. This study introduces synthetic spider silk—multiarm PEG bioconjugates, facilitating spidroin crosslinking, and chemical functionalization while retaining a biomimetic spinning approach. Two different examples demonstrate the potential of this approach to improve the fiber's tensile strength and extensibility, respectively, both leading to an increased toughness modulus. Furthermore, the approach could allow the tuning of fiber mechanical properties without developing a new mini‐spidroin construct and fiber coating with lipids attached to multiarm PEG, potentially mitigating the impact of environmental conditions on synthetic spider silk fibers.

Abstract Oligomeric species populated during α-synuclein aggregation are considered key drivers of neurodegeneration in Parkinson’s disease. However, their structure and the molecular determinants driving their conversion to fibrils remain elusive. In this work, we determined the symmetry and architecture of α-synuclein oligomers, dissecting the conformational properties of individual chains within these toxic assemblies. We demonstrate that the NAC domain is insufficient to promote oligomer to fibril conversion; instead, this transition is controlled by a short α-synuclein N-terminal motif. A missense mutation causing early-onset Parkinson’s disease remodels this N-terminal region conformation, which results in a population of long-lived oligomers less susceptible to disaggregation by the human Hsp70 machinery. Our results provide a structural understanding of oligomer to amyloid conversion and identify targets for therapeutic intervention. One sentence summary α-Synuclein oligomers are symmetric and well-organized particles with a short N-terminal region controlling fibril conversion.

Abstract Solid-state NMR spectroscopy is a powerful technique to study insoluble and non-crystalline proteins and protein complexes at atomic resolution. The development of proton ( 1 H) detection at fast magic-angle spinning (MAS) has considerably increased the analytical capabilities of the technique, enabling the acquisition of 1 H-detected fingerprint experiments in few hours. Here an approach based on double-quantum (DQ) 13 C spectroscopy, detected on 1 H, is introduced at fast MAS (70 kHz) to perform the sequential assignment of insoluble proteins of small size, without any specific deuteration requirement. By combining two three-dimensional 1 H detected experiments correlating a 13 C DQ dimension respectively to its intra-residue and sequential 15 N- 1 H pairs, a sequential walk through DQ (Cα+CO) resonance is obtained. Our approach takes advantage of fast MAS to achieve an efficient sensitivity and the addition of a DQ dimension provides spectral features useful for the resonance assignment process.

NLRs (Nod-like receptors) are intracellular receptors regulating immunity, symbiosis, non-self recognition and programmed cell death in animals, plants and fungi. Several fungal NLRs employ amyloid signaling motifs to activate downstream cell-death inducing proteins. Herein, we identify in Archaea and Bacteria, short sequence motifs that occur in the same genomic context as fungal amyloid signaling motifs. We identify 10 families of bacterial amyloid signaling sequences (we term BASS), one of which (BASS3) is related to mammalian RHIM and fungal PP amyloid motifs. We find that BASS motifs occur specifically in bacteria forming multicellular structures (mainly in Actinobacteria and Cyanobacteria). We analyze experimentally a subset of these motifs and find that they behave as prion forming domains when expressed in a fungal model. All tested bacterial motifs also formed fibrils in vitro. We analyze by solid-state NMR and X-ray diffraction, the amyloid state of a protein from Streptomyces coelicolor bearing the most common BASS1 motif and find that it forms highly ordered non-polymorphic amyloid fibrils. This work expands the paradigm of amyloid signaling to prokaryotes and underlies its relation to multicellularity.

Abstract The microtubule-associated protein tau forms disease-specific filamentous aggregates in several different neurodegenerative diseases. In order to understand how tau undergoes misfolding into a specific filament type and to control this process for drug development purposes, it is crucial to study in vitro tau aggregation methods and investigate the structures of the obtained filaments at the atomic level. Here, we used the tau fragment dGAE, which aggregates spontaneously, to seed the formation of full-length tau filaments. The structures of dGAE and full-length tau filaments were investigated by solid-state MAS NMR, showing that dGAE allows propagation of a chronic traumatic encephalopathy (CTE)-like fold to the full-length tau. The obtained filaments efficiently seeded tau aggregation in HEK293T cells. This work demonstrates that in vitro preparation of disease-specific types of full-length tau filaments is feasible.

Abstract Biofilms are bacterial communities that result from a cell differentiation process that leads to the secretion of an extracellular matrix (ECM) by part of the bacterial population. In Bacillus subtilis, the main protein component of the ECM is the functional amyloid TasA, which forms a fiber-based scaffold that confers structure to the ECM. The N-terminal half of TasA is strongly conserved among Bacillus species and contains a protein domain, the amyloid core (AcTasA), which is critical for the formation of the amyloid architecture. In this study, we demonstrate that recombinantly purified AcTasA in vitro retains biochemical properties previously observed for the entire protein. Further analysis of the AcTasA amino acid sequence revealed two amyloidogenic stretches and a region of imperfect amino acid repeats, which are known to contribute to functional amyloid assembly. Biochemical characterization of these amyloidogenic stretches found in AcTasA revealed their amyloid capacity in vitro , contributing to the amyloid nature of AcTasA. Moreover, the study of the imperfect amino acid repeats revealed the critical role of residues D64, K68 and D69 in the structural function of TasA. In vivo and in vitro experiments with versions of TasA carrying the substitutions D64A, K68A, and D69A demonstrated a partial loss of function of the protein either in the assembly of the ECM or in the stability of the core and amyloid polymerization. Taken together, our findings allow us to better understand the polymerization process of TasA during biofilm formation and provide knowledge into the sequence determinants that promote the molecular behavior of functional amyloids.

Abstract Intraneuronal α-synuclein inclusions in the brain are hallmarks of so-called Lewy body diseases - Parkinson’s disease and Dementia with Lewy bodies. Lewy bodies are cytoplasmic inclusions, containing mainly aggregated α-synuclein together with some other proteins including ubiquitin, neurofilament protein, and alpha B crystallin. In its monomeric form, α-synuclein is predominantly localized in nerve terminals, regulating neuronal transmission and synaptic vesicle trafficking. Monomeric α-synuclein lacks a well-defined three-dimensional structure and is considered an intrinsically disordered protein. However, in diseased cells α-synuclein aggregates into oligomeric and fibrillar amyloid species, which can be detected using aggregate-specific antibodies. Here we investigate the aggregate specificity of rabbit monoclonal MJFR14-6-4-2 antibodies, preferentially recognizing aggregated α-synuclein species. We conclude that partial masking of epitope in unstructured monomer in combination with a high local concentration of epitopes instead of distinct epitope conformation is the main reason for apparent selectivity towards various aggregates, including oligomers, fibrils, and artificial virus-like particle constructs bearing multiple copies of the MJFR14-6-4-2 epitope. Based on the structural insight, we were able to express mutant α-synuclein that when fibrillated are unable to bind MJFR14-6-4-2. Using these “stealth” fibrils as a tool for seeding cellular α-synuclein aggregation, provides superior signal/noise ratio for detection of cellular α-synuclein aggregates by MJFR14-6-4-2 immunocytochemistry. Our data provide a molecular level understanding of specific recognition of toxic amyloid oligomers, which is critical for the development of inhibitors against synucleinopathies.

The conformational strain diversity characterizing α-synuclein (α-syn) amyloid fibrils is possibly at the origin of the different clinical presentations of synucleinopathies. Experimentally, various α-syn fibril polymorphs have been obtained from distinct fibrillization conditions by altering the medium constituents and were selected by amyloid monitoring using the probe Thioflavin T (ThT). We report here that besides classical ThT positive products, fibrillization in saline simultaneously gives rise to competing fibril polymorphs that are invisible to ThT (stealth polymorphs), and that can take over. Due to competition, spontaneous generation of such stealth polymorphs bears on the apparent fibrillization kinetics and on the final plateau values. Their emergence has thus been ignored so far or mistaken for fibrillization inhibitions/failures. Compared to their ThT-positive counterparts, and as judged from their chemical shift resonances fingerprint, these new stealth polymorphs present a yet undescribed atomic organization and show an exacerbated propensity (approx. 20-fold) towards self-replication in cortical neurons. They also trigger a long distance synucleinopathic spread along nigro-striatal projections in vivo. In order to rapidly screen fibrillization products for the presence of such stealth polymorphs, we designed a simple multiplexed assay that can be easily and rapidly operated. This assay allows us to demonstrate the sustainability of the conformational replication of these novel and particularly invasive strains. It should also be of help to avoid erroneous upstream interpretations of fibrillization rates based on sole ThT, and to expedite further structural and functional characterization of stealth amyloid assemblies.