ABSTRACT Hearing loss is a major health problem worldwide. Numerous attempts at regenerating functional hair cells (HCs) have been unsuccessful, but little is known about the main barrier that prevents us from achieving it and improving the hearing ability after damage. Here, we developed an in vivo genetic mouse model, by which the inner HCs (IHCs), the primary sound receptors innervated by the auditory neurons, were specifically damaged and the neighboring nonsensory supporting cells (SCs) were transformed into IHCs by ectopic expression of transient Atoh1 and permanent Tbx2. Despite ∼477 new IHCs were regenerated per cochlea and their differentiation status was more advanced than reported previously, no significant hearing improvement was achieved. By taking advantage of this unique model, we further found that the new IHCs expressed the functional marker vGlut3, harbored the similar transcriptomic profiles and electrophysiological properties as the endogenous IHCs. However, the mechanosensory transduction (MET) current could not be recorded in the new IHCs. Thus, our study indicated that the defective MET should be the main barrier that stops us from restoring the hearing capacity in the damaged cochlea and would pave the way for regenerating IHCs in vivo .

Abstract Atoh1 is essential for the development of outer hair cells (OHCs) and inner hair cells (IHCs) in the mammalian cochlea. Whereas Ikzf2 is necessary for OHC development, the key gene for IHC development remains unknown. We found that deleting Tbx2 in neonatal IHCs led to their trans-differentiation into OHCs, by repressing 26.7% of IHC and inducing 56.3% of OHC genes, including Ikzf2 . More importantly, persistent expression of Tbx2 together with transient Atoh1 effectively reprogramed non-sensory supporting cells into new IHCs expressing functional IHC marker vGlut3. The differentiation status of these new IHCs is much more advanced than those previously reported. Thus, Tbx2 is essential for IHC development, and its co-upregulation with Atoh1 in supporting cells represents a new approach for treating IHC degeneration-related deafness.

Abstract The cochlea, the auditory organ, contains two types of sound receptors: inner hair cells (IHCs) and outer hair cells (OHCs). Tbx2 is expressed in IHCs but repressed in OHCs. The neonatal OHCs with Tbx2 misexpression transdifferentiate into IHC-like cells. However, the extent of the switch from OHCs to IHC-like cells and the underlying molecular mechanism remain poorly understood. Furthermore, it is unknown whether Tbx2 can transform fully mature adult OHCs into IHC-like cells. In this study, we employ single-cell transcriptomic analysis, revealing that 85.6% of IHC genes, including Slc17a8 , are upregulated, whereas only 38.6% of OHC genes, including Ikzf2 and Slc26a5 , are downregulated in neonatal OHCs with Tbx2 misexpression. Thus, our findings suggest that Tbx2 cannot fully reprogram neonatal OHCs into IHCs, contrary to previous assumptions. Consistently, Tbx2 also fails to fully reprogram cochlear progenitors into IHCs. Finally, Ikzf2 restoration alleviates the abnormalities present in the Tbx2+ OHCs, supporting the notion that Ikzf2 repression by Tbx2 contributes to the transdifferentiation of OHCs into IHC-like cells. Overall, our study reevaluates the effects of ectopic Tbx2 expression on OHC lineage development at different stages and provides molecular insights into how Tbx2 disrupts the gene expression profiles of OHCs. This research also lays the groundwork for future studies on OHC regeneration. Significance Statement Understanding the molecular and genetic mechanisms that govern the determination and stability of cochlear inner hair cells (IHCs) and outer hair cells (OHCs) would provide valuable insights into regenerating damaged IHCs and OHCs. In this manuscript, we conduct in vivo conditional overexpression of Tbx2 in cochlear sensory progenitors, neonatal OHCs and adult OHCs, respectively. Our findings challenge previous assumptions by revealing that Tbx2 expression alone can partially destabilize OHC fates but cannot fully convert OHCs into IHCs. Specifically, we demonstrate that the repression of Ikzf2 expression due to Tbx2 overexpression is one of the key pathways disrupting OHC fate.