Abstract Global profile of gene expression at single-cell resolution remains to be determined for primates. Using a recently developed technology (“Stereo-seq”), we have obtained a comprehensive single-cell spatial transcriptome map at the whole-brain level for cynomolgus monkeys, with ∼600 genes per cell for 10 μm-thick coronal sections (up to 15 cm 2 in size). Large-scale single-nucleus RNA-seq analysis for ∼1 million cells helped to identify cell types corresponding to Stereo-seq gene expression profiles, providing a 3-D cell type atlas of the monkey brain. Quantitative analysis of Stereo-seq data revealed molecular fingerprints that mark distinct neocortical layers and subregions, as well as domains within subcortical structures including hippocampus, thalamus, striatum, cerebellum, hypothalamus and claustrum. Striking whole-brain topography and coordinated patterns were found in the expression of genes encoding receptors and transporters for neurotransmitters and neuromodulators. These results pave the way for cellular and molecular understanding of organizing principles of the primate brain.

ABSTRACT Mammalian cochlear outer hair cells (OHCs) are essential for hearing. OHC degeneration causes severe hearing impairment. Previous attempts of regenerating new OHCs from cochlear supporting cells (SCs) had yielded cells lacking Prestin, a key motor protein for OHC function. Thus, regeneration of Prestin+ OHCs remains a challenge for repairing OHC damage in vivo . Here, we reported that successful in vivo conversion of adult cochlear SCs into Prestin+ OHC-like cells could be achieved by simultaneous expression of Atoh1 and Ikzf2, two key transcriptional factors necessary for OHC development. New OHC-like cells exhibited upregulation of hundreds of OHC genes and downregulation of SC genes. Single cell transcriptomic analysis demonstrated that the differentiation status of these OHC-like cells was much more advanced than previously achieved. Thus, we have established an efficient approach to promote regeneration of Prestin+ OHCs and paved the way for repairing damaged cochlea in vivo via transdifferentiation of SCs.

ABSTRACT Mammals harbor a limited number of sound-receptor hair cells (HCs) that cannot be regenerated after damage. Thus, investigating the underlying molecular mechanisms that maintain HC survival is crucial for preventing hearing impairment. Intriguingly, Pou4f3 -/- or Gfi1 -/- HCs form initially but then rapidly degenerate, whereas Rbm24 -/- HCs degenerate considerably later. However, the transcriptional cascades involving Pou4f3, Gfi1, and Rbm24 remains undescribed. Here, we demonstrate that Rbm24 expression is completely repressed in Pou4f3 -/- HCs but unaltered in Gfi1 -/- HCs, and further that the expression of both POU4F3 and GFI1 is intact in Rbm24 -/- HCs. Moreover, by using in vivo mouse transgenic reporter assays, we identify three Rbm24 enhancers to which POU4F3 binds. Lastly, through in vivo genetic testing of whether Rbm24 restoration alleviates the degeneration of Pou4f3 -/- HCs, we show that ectopic Rbm24 alone cannot prevent Pou4f3 -/- HCs from degenerating. Collectively, our findings provide new molecular and genetic insights into how HC survival is regulated.

ABSTRACT Hearing loss is a major health problem worldwide. Numerous attempts at regenerating functional hair cells (HCs) have been unsuccessful, but little is known about the main barrier that prevents us from achieving it and improving the hearing ability after damage. Here, we developed an in vivo genetic mouse model, by which the inner HCs (IHCs), the primary sound receptors innervated by the auditory neurons, were specifically damaged and the neighboring nonsensory supporting cells (SCs) were transformed into IHCs by ectopic expression of transient Atoh1 and permanent Tbx2. Despite ∼477 new IHCs were regenerated per cochlea and their differentiation status was more advanced than reported previously, no significant hearing improvement was achieved. By taking advantage of this unique model, we further found that the new IHCs expressed the functional marker vGlut3, harbored the similar transcriptomic profiles and electrophysiological properties as the endogenous IHCs. However, the mechanosensory transduction (MET) current could not be recorded in the new IHCs. Thus, our study indicated that the defective MET should be the main barrier that stops us from restoring the hearing capacity in the damaged cochlea and would pave the way for regenerating IHCs in vivo .

Abstract Atoh1 is essential for the development of outer hair cells (OHCs) and inner hair cells (IHCs) in the mammalian cochlea. Whereas Ikzf2 is necessary for OHC development, the key gene for IHC development remains unknown. We found that deleting Tbx2 in neonatal IHCs led to their trans-differentiation into OHCs, by repressing 26.7% of IHC and inducing 56.3% of OHC genes, including Ikzf2 . More importantly, persistent expression of Tbx2 together with transient Atoh1 effectively reprogramed non-sensory supporting cells into new IHCs expressing functional IHC marker vGlut3. The differentiation status of these new IHCs is much more advanced than those previously reported. Thus, Tbx2 is essential for IHC development, and its co-upregulation with Atoh1 in supporting cells represents a new approach for treating IHC degeneration-related deafness.

The inactivation of Rbm24, an RNA-binding protein, results in the degeneration of cochlear outer hair cells (OHCs) during the postnatal period. However, the specific molecular mechanisms underlying this OHC death remain elusive. To address this, we conducted a comprehensive analysis comparing the gene profiles of wild-type OHCs to those lacking Rbm24 (Rbm24-/-) at postnatal day 7 (P7). Our results revealed that the overall differentiation program of OHCs is delayed in the absence of Rbm24. Furthermore, the expression of Insm1, a crucial factor for OHC development that is normally switched off by P2, remains prolonged in Rbm24-/- OHCs. Interestingly, when Insm1 is overexpressed, it also leads to OHC death. Significantly, the OHC degeneration is much less severe when both Rbm24 and Insm1 are simultaneously inactivated. These findings shed light on the important role of Rbm24 in repressing Insm1 and its impact on OHC differentiation and survival. Our study provides valuable insights into the complex genetic signaling pathways involved in OHC development.

Abstract Ultrasonic hearing is exploited for hunting and navigation as in echolocation by microbats and bottleneck dolphins, and for social communication like ultrasonic vocalization by mice and rats. However, the molecular and cellular basis for ultrasonic hearing is not known yet. Here we show that knockout of the mechanosensitive ion channel PIEZO2 in cochlea disrupts the ultrasonic hearing but not the low-frequency hearing in mice, as shown by audiometry and acoustically-associative freezing behavior. Deletion of Piezo2 in the outer hair cells specifically abolishes the associative learning of the mice upon hearing the ultrasonic frequency. Ex vivo cochlear Ca 2+ imaging revealed that the ultrasonic transduction requires both PIEZO2 and the hair-cell mechanotransduction channel. Together, our study demonstrates that the outer hair cells are the effector cells with PIEZO2 as an essential molecule for ultrasonic hearing in mice. Significance Statement Some animals have evolved an incredible ability for vocalizing and hearing ultrasonic frequencies that is inaudible for humans (> 20 kHz). For many years, it has been considered that animals hear ultrasonic frequencies with their cochlear hair cells, using the identical set of mechanotransduction molecules in the hair bundles for hearing audible frequencies. Here, we show that the mice lacking the mechanosensitive ion channel PIEZO2 hardly hear ultrasonic frequencies, while can still be sensitive to audible frequencies. Thus, animals may use a partially different mechanism for sensing physiological ultrasound.

Abstract The cochlea, the auditory organ, contains two types of sound receptors: inner hair cells (IHCs) and outer hair cells (OHCs). Tbx2 is expressed in IHCs but repressed in OHCs. The neonatal OHCs with Tbx2 misexpression transdifferentiate into IHC-like cells. However, the extent of the switch from OHCs to IHC-like cells and the underlying molecular mechanism remain poorly understood. Furthermore, it is unknown whether Tbx2 can transform fully mature adult OHCs into IHC-like cells. In this study, we employ single-cell transcriptomic analysis, revealing that 85.6% of IHC genes, including Slc17a8 , are upregulated, whereas only 38.6% of OHC genes, including Ikzf2 and Slc26a5 , are downregulated in neonatal OHCs with Tbx2 misexpression. Thus, our findings suggest that Tbx2 cannot fully reprogram neonatal OHCs into IHCs, contrary to previous assumptions. Consistently, Tbx2 also fails to fully reprogram cochlear progenitors into IHCs. Finally, Ikzf2 restoration alleviates the abnormalities present in the Tbx2+ OHCs, supporting the notion that Ikzf2 repression by Tbx2 contributes to the transdifferentiation of OHCs into IHC-like cells. Overall, our study reevaluates the effects of ectopic Tbx2 expression on OHC lineage development at different stages and provides molecular insights into how Tbx2 disrupts the gene expression profiles of OHCs. This research also lays the groundwork for future studies on OHC regeneration. Significance Statement Understanding the molecular and genetic mechanisms that govern the determination and stability of cochlear inner hair cells (IHCs) and outer hair cells (OHCs) would provide valuable insights into regenerating damaged IHCs and OHCs. In this manuscript, we conduct in vivo conditional overexpression of Tbx2 in cochlear sensory progenitors, neonatal OHCs and adult OHCs, respectively. Our findings challenge previous assumptions by revealing that Tbx2 expression alone can partially destabilize OHC fates but cannot fully convert OHCs into IHCs. Specifically, we demonstrate that the repression of Ikzf2 expression due to Tbx2 overexpression is one of the key pathways disrupting OHC fate.

Drosophila type II neuroblasts produce numerous neurons and glia due to transiently amplifying, intermediate neural progenitors (INP). Consecutively born INPs produce morphologically distinct progeny, presumably due to temporal patterning in type II neuroblasts. We therefore profiled type II neuroblasts transcriptome across time. Our results reveal opposing temporal gradients of Imp and Syp RNA-binding proteins (descending and ascending, respectively). Maintaining Imp expression throughout brain development expands the number of neurons/glia with early temporal fate at the expense of cells with late fate. Conversely, precocious upregulation of Syp reduces the number of cells with early fate. Further, we reveal that the transcription factor, Seven-up initiates progression of the Imp/Syp gradients. Interestingly, genetic manipulations that fix Imp or Syp levels still yield progeny with a small range of early fates. We propose that the Seven-up-initiated Imp/Syp gradients create coarse temporal windows within type II neuroblasts to pattern INPs, which subsequently undergo fine-tuned subtemporal patterning.

A comprehensive atlas of genes, cell types, and their spatial distribution across a whole mammalian brain is fundamental for understanding function of the brain. Here, using snRNA-seq and Stereo-seq techniques, we generated a mouse brain atlas with spatial information for 308 cell clusters with single-cell resolution involving over 6 million cells as well as for 29,655 genes. We have identified new astrocyte clusters, and demonstrated that distinct cell clusters exhibit preference for cortical subregions. In addition, we identified 155 genes exhibiting regional specificity in the brainstem, and 513 long non-coding RNA exhibited regional specificity in the adult brain. Parcellation of brain regions based on spatial transcriptomic information showed large overlap with that by traditional method. Furthermore, we have uncovered 411 transcription factor regulons with spatiotemporal specificity during development. Thus, our study has discovered genes and regulon with spatiotemporal specificity, and provided a high-resolution spatial transcriptomic atlas of the mouse brain.