SUMMARY Microvilli are actin bundle supported surface protrusions that play essential roles in diverse epithelial cell functions. To develop our understanding of microvilli biogenesis, we used live imaging to directly visualize protrusion growth at early stages of epithelial differentiation. Time-lapse data revealed that an “initiation complex” enriched in EPS8 and IRTKS appears at future sites of microvillus growth minutes before core actin bundle assembly. Elongation of a new core bundle occurs in parallel with the arrival of EZRIN and plasma membrane encapsulation. In addition to de novo growth, we also observed that new microvilli emerge from pre-existing protrusions. Additionally, we found that new microvilli can also collapse, characterized first by loss of membrane wrapping and Ezrin enrichment, followed by a sharp decrease in distal tip EPS8 and IRTKS. These studies are the first to offer a temporally resolved microvillus growth mechanism and highlight critical factors that drive this process.

Differentiated transporting epithelial cells present an extensive apical array of microvilli - a "brush border" - where neighboring microvilli are linked together by intermicrovillar adhesion complexes (IMACs) composed of protocadherins CDHR2 and CDHR5. Although loss-of-function studies provide strong evidence that IMAC function is needed to build a mature brush border, how the IMAC contributes to the stabilization and accumulation of nascent microvilli remains unclear. We found that, early in differentiation, the apical surface exhibits a marginal accumulation of microvilli, characterized by higher packing density relative to medial regions of the surface. While medial microvilli are highly dynamic and sample multiple orientations over time, marginal protrusions exhibit constrained motion and maintain a vertical orientation. Unexpectedly, we found that marginal microvilli span the junctional space and contact protrusions on neighboring cells, mediated by complexes of CDHR2/CDHR5. FRAP analysis indicated that these transjunctional IMACs are highly stable relative to adhesion complexes between medial microvilli, which explains the restricted motion of protrusions in the marginal zone. Finally, long-term live imaging revealed that the accumulation of microvilli at cell margins consistently leads to accumulation in medial regions of the cell. Collectively, our findings suggest that nascent microvilli are stabilized by a capture mechanism that is localized to cell margins and enabled by the transjunctional formation of IMACs. These results inform our understanding of how apical specializations are assembled in diverse epithelial systems.

Transporting epithelial cells in the gut and kidney rely on protocadherin-based apical adhesion complexes to organize microvilli that extend into luminal space. In these systems, CDHR2 and CDHR5 localize to the distal ends of microvilli, where they form an intermicrovillar adhesion complex (IMAC) that links the tips of these structures, promotes the formation of a well-ordered array of protrusions, and thus maximizes apical membrane surface area. Recently, we discovered that IMACs can also form between microvilli that extend from neighboring cells, across cell-cell junctions. As an additional point of physical contact between cells, transjunctional IMACs are well positioned to impact the integrity of canonical tight and adherens junctions that form more basolaterally. To begin to test this idea, we examined cell culture and mouse models that lacked CDHR2 expression and were unable to form IMACs. CDHR2 knockout perturbed cell and junction morphology, reduced key components from tight and adherens junctions, impaired barrier function, and increased the motility of single cells within established monolayers. These results support the hypothesis that, in addition to organizing apical microvilli, IMACs provide a layer of cell-cell contact that functions in parallel with canonical tight and adherens junctions to promote epithelial functions. [Media: see text].

ABSTRACT Transporting epithelial cells in the gut and kidney rely on protocadherin-based apical adhesion complexes to organize microvilli that extend into the luminal space. In these systems, CDHR2 and CDHR5 localize to the distal ends of microvilli, where they form an intermicrovillar adhesion complex (IMAC) that links the tips of these structures, promotes the formation of a well-ordered array of protrusions, and in turn maximizes apical membrane surface area. Recently, we discovered that IMACs can also form between microvilli that extend from neighboring cells, across cell-cell junctions. As an additional point of physical contact between cells, transjunctional IMACs are well positioned to impact the integrity of canonical tight and adherens junctions that form more basolaterally. Here, we sought to test this idea using cell culture and mouse models that lacked CDHR2 expression and were unable to form IMACs. CDHR2 knockout perturbed cell and junction morphology, led to loss of key components from tight and adherens junctions, and impaired barrier function and wound healing. These results indicate that, in addition to organizing apical microvilli, IMACs provide a layer of cell-cell contact that functions in parallel with canonical tight and adherens junctions to support the physiological functions of transporting epithelia.