The notion that all protein functions are determined through macromolecular interactions is the driving force behind current efforts that aim to solve the structures of all cellular complexes. Recent findings, however, demonstrate a significant amount of structural disorder or polymorphism in protein complexes, a phenomenon that has been largely overlooked thus far. It is our view that such disorder can be classified into four mechanistic categories, covering a continuous spectrum of structural states from static to dynamic disorder and from segmental to full disorder. To emphasize its generality and importance, we suggest a generic term, ‘fuzziness’, for this phenomenon. Given the crucial role of protein disorder in protein–protein interactions and in regulatory processes, we envision that fuzziness will become integral to understanding the interactome. The notion that all protein functions are determined through macromolecular interactions is the driving force behind current efforts that aim to solve the structures of all cellular complexes. Recent findings, however, demonstrate a significant amount of structural disorder or polymorphism in protein complexes, a phenomenon that has been largely overlooked thus far. It is our view that such disorder can be classified into four mechanistic categories, covering a continuous spectrum of structural states from static to dynamic disorder and from segmental to full disorder. To emphasize its generality and importance, we suggest a generic term, ‘fuzziness’, for this phenomenon. Given the crucial role of protein disorder in protein–protein interactions and in regulatory processes, we envision that fuzziness will become integral to understanding the interactome. β-catenin binding domain of Tcf4. cell-division cycle 4 protein, an E3 ubiquitin ligase that targets Sic1, a cyclin-dependent kinase (Cdk) inhibitor, for degradation. cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, a phosphorylation-regulated Cl− channel in the epithelial cell membrane. cyclic AMP response element-binding protein, a transcription factor responding to elevated cAMP levels. C-terminal domain of proteins. DNA fragmentation factor 40, responsible for internucleosomal DNA cleavage during the terminal stages of programmed cell death. dihydropyridine receptor, a Ca++ channel in the sarcoplasmic reticulum membrane of skeletal muscle, the primary sensor of action potential depolarization in excitation–contraction coupling. Ewing's sarcoma (EWS) fusion protein, generated by chromosomal translocations of the EWS oncogene in distinct human cancers. fibronectin-binding protein, a bacterial cell-wall anchored protein that binds to the extracellular matrix of the host. fusion 3 protein, a mitogen-activated protein kinase (MAPK) in the mating (pheromone) response MAPK cascade in S. cerevisiae. heat-shock protein 25, a member of the small heat-shock protein family, a chaperone. heat-shock protein 90, one of the best-characterized chaperones. inhibitor of aspartic proteinase A in S. cerevisiae. kinase-inducible domain of CREB transcription factor. domain of CREB-binding protein (CBP), which binds to the KID domain of CREB. nuclear localization signal, a short motif that directs the protein into the nucleus. octamer-binding factor 1, a transcription factor that stimulates transcription of immunoglobulin genes. Pit-1, Oct-1, Oct-2, Unc-86; helix-turn-helix DNA-binding domain. protein phosphatase 5, involved in cellular proliferation, migration, differentiation and survival. infectious protein, able to undergo autocatalytic, self-sustaining transition to the amyloid state. RNA polymerase II, a large multiprotein complex that transcribes protein-coding genes in eukaryotes. ryanodine receptor, a Ca++ channel in the sarcoplasmic reticulum membrane of skeletal muscle functioning in excitation–contraction coupling. splicing factor 1, a protein involved in the initial steps of pre-mRNA splicing. domain = Src-homology domain 3, a domain to which proline-rich sequences bind, often involved in protein–protein interactions in signalling pathways. S-phase Cdk inhibitor 1, implicated in the transition from G1 to S phase in yeast. promoter-specific factor 1, a zinc finger transcription factor that binds to GC box promoter elements. sterile 5 protein, a scaffold protein functioning in the mating (pheromone) response MAPK cascade in S. cerevisiae. transactivator domain, the domain of transcription factors that interacts with components of the general transcription machinery. T cell factor 4, a transcription factor of the Tcf–LEF family involved in Wnt signalling, stem cell replication and differentiation. tetratricopeptide domain, an alpha-helical repeat domain often involved in protein–protein interactions.

Intrinsically unstructured proteins (IUPs) are devoid of extensive structural order but often display signs of local and limited residual structure. To explain their effective functioning, we reasoned that such residual structure can be crucial in their interactions with their structured partner(s) in a way that preformed structural elements presage their final conformational state. To check this assumption, a database of 24 IUPs with known 3D structures in the bound state has been assembled and the distribution of secondary structure elements and backbone torsion angles have been analysed. The high proportion of residues in coil conformation and with φ, ψ angles in the disallowed regions of the Ramachandran map compared to the reference set of globular proteins shows that IUPs are not fully ordered even in their bound form. To probe the effect of partner proteins on IUP folding, inherent conformational preferences of IUP sequences have been assessed by secondary structure predictions using the GOR, ALB and PROF algorithms. The accuracy of predicting secondary structure elements of IUPs is similar to that of their partner proteins and is significantly higher than the corresponding values for random sequences. We propose that strong conformational preferences mark regions in IUPs (mostly helices), which correspond to their final structural state, while regions with weak conformational preferences represent flexible linkers between them. In our interpretation, preformed elements could serve as initial contact points, the binding of which facilitates the reeling of the flexible regions onto the template. This finding implies that IUPs draw a functional advantage from preformed structural elements, as they enable their facile, kinetically and energetically less demanding, interaction with their physiological partner.

Abstract Motivation: The dynamic nature of protein interaction networks requires fast and transient molecular switches. The underlying recognition motifs (linear motifs, LMs) are usually short and evolutionarily variable segments, which in several cases, such as phosphorylation sites or SH3-binding regions, fall into locally disordered regions. We probed the generality of this phenomenon by predicting the intrinsic disorder of all LM-containing proteins enlisted in the Eukaryotic Linear Motif (ELM) database. Results: We demonstrated that LMs in average are embedded in locally unstructured regions, while their amino acid composition and charge/hydropathy properties exhibit a mixture characteristic of folded and disordered proteins. Overall, LMs are constructed by grafting a few specificity-determining residues favoring structural order on a highly flexible carrier region. These results establish a connection between LMs and molecular recognition elements of intrinsically unstructured proteins (IUPs), which realize a non-conventional mode of partner binding mostly in regulatory functions. Contact: simon@enzim.hu Supplementary information: Supplementary data are available at Bioinformatics online.

Summary

 Alternative inclusion of exons increases the functional diversity of proteins. Among alternatively spliced exons, tissue-specific exons play a critical role in maintaining tissue identity. This raises the question of how tissue-specific protein-coding exons influence protein function. Here we investigate the structural, functional, interaction, and evolutionary properties of constitutive, tissue-specific, and other alternative exons in human. We find that tissue-specific protein segments often contain disordered regions, are enriched in posttranslational modification sites, and frequently embed conserved binding motifs. Furthermore, genes containing tissue-specific exons tend to occupy central positions in interaction networks and display distinct interaction partners in the respective tissues, and are enriched in signaling, development, and disease genes. Based on these findings, we propose that tissue-specific inclusion of disordered segments that contain binding motifs rewires interaction networks and signaling pathways. In this way, tissue-specific splicing may contribute to functional versatility of proteins and increases the diversity of interaction networks across tissues.

Abstract Misfolded α-synuclein is a major component of Lewy bodies, which are a hallmark of Parkinson’s disease. A large body of evidence shows that α-synuclein can self-assemble into amyloid fibrils, but the relationship between amyloid formation and Lewy body formation still remains unclear. Here we show, both in vitro and in a C. elegans model of Parkinson’s disease, that α-synuclein undergoes liquid-liquid phase separation by forming a liquid droplet state, which converts into an amyloid-rich hydrogel. This maturation process towards the amyloid state is delayed in the presence of model synaptic vesicles in vitro . Taken together, these results suggest that the formation of Lewy bodies is linked to the arrested maturation of α-synuclein condensates in the presence of lipids and other cellular components.

Abstract Disordered proteins can fold into a well-defined structure upon binding but these complexes are often fuzzy: the originally disordered partner adopts different binding modes when bound to different partners. Here we perform a systematic analysis of 160 proteins that form fuzzy complexes and demonstrate that the disordered partner displays a high degree of frustration in both the free and bound states. Although the folding of disordered regions upon binding reduces frustration relative to that of the unbound state, the interactions at the binding interface do not become fully optimized. In addition, we show that sub-optimal interactions lead to alternative frustration patterns in the complexes with different partners. These results demonstrate that disordered proteins do not always achieve fully optimal interactions in their complexes and their residual frustration leads to interaction versatility with different partners.

Abstract A wide range of proteins have been reported to condensate into a dense liquid phase, forming a reversible droplet state. Failure in the control of the droplet state can lead to the formation of the more stable amyloid state, which is often disease-related. These observations prompt the question of how many proteins can undergo liquid-liquid phase separation. Here, in order to address this problem, we discuss the biophysical principles underlying the droplet state of proteins by analyzing current evidence for droplet-driver and droplet-client proteins. Based on the concept that the droplet state is stabilized by the large conformational entropy associated with non-specific side-chain interactions, we develop the FuzDrop method to predict droplet-promoting regions and proteins, which can spontaneously phase separate. We use this approach to carry out a proteome-level study to rank proteins according to their propensity to form the droplet state, spontaneously or via partner interactions. Our results lead to the conclusion that the droplet state could be, at least transiently, accessible to most proteins under conditions found in the cellular environment. Significance Liquid-liquid phase separation of proteins results in biomolecular condensates, which contribute to the organisation of cellular matter into membraneless organelles. It is still unclear, however, whether these condensates represent a common state of proteins. Here, based on biophysical principles driving phase separation, we report a proteome-wide ranking of proteins according to their propensity to condensate into a droplet state. We analyze two mechanisms for droplet formation - driver proteins can spontaneously phase separate, while client proteins require additional components. We conclude that the droplet state, as the native and amyloid states, is a fundamental state of proteins, with most proteins expected to be capable of undergoing liquid-liquid phase separation via either of these two mechanisms.

Abstract Many proteins have been recently shown to undergo a process of phase separation that leads to the formation of biomolecular condensates. Intriguingly, it has been observed that some of these proteins form dense droplets of sizeable dimensions already below the transition concentration, which is the concentration at which phase separation occurs. To understand this phenomenon, which is not readily compatible with classical nucleation theory, we investigated the properties of the droplet size distributions as a function of protein concentration. We found that these distributions can be described by a scale-invariant log-normal function with an average that increases progressively as the concentration approaches the transition concentration from below. These results suggest the existence of a universal behaviour independent of the sequences and structures of the proteins undergoing phase separation, which is typically observed for second-order phase transitions. Based on these observations, we show that it is possible to use the scale invariance to estimate the critical concentration for phase separation.

Abstract The transition between the native and amyloid states of proteins can proceed via a deposition pathway via oligomeric intermediates or via a condensation pathway via liquid droplet intermediates generated through liquid-liquid phase separation. Here we investigate the sequence determinants of aggregation from within the droplet state based on generic interactions. We describe a model in which these sequence determinants can be captured by three features, the droplet-promoting propensity, the aggregation-promoting propensity and the binding mode entropy. By using this approach, we propose a formula to identify aggregation-promoting mutations in droplet-forming proteins. This analysis provides insights into the amino acid code for the conversion of proteins between liquid-like and solid-like condensates.

Transcription factors (TFs) play multiple roles in different cells and stages of development. Given this multitude of functional roles it has been assumed that TFs are evolutionarily highly constrained. Here we investigate the molecular mechanisms for the origin of a derived functional interaction between two TFs that play a key role in mammalian pregnancy, HOXA11 and FOXO1. We have previously shown that the regulatory role of HOXA11 in mammalian endometrial stromal cells requires an interaction with FOXO1, and that the physical interaction between these proteins evolved long before their functional cooperativity. Through a combination of functional, biochemical, and structural approaches, we demonstrate that the derived functional cooperativity between HOXA11 and FOXO1 is due to derived allosteric regulation of HOXA11 by FOXO1. This study shows that TF function can evolve through changes affecting the functional output of a pre-existing protein complex.