The BioID method uses a promiscuous biotin ligase to detect protein–protein associations as well as proximate proteins in living cells. Here we report improvements to the BioID method centered on BioID2, a substantially smaller promiscuous biotin ligase. BioID2 enables more-selective targeting of fusion proteins, requires less biotin supplementation, and exhibits enhanced labeling of proximate proteins. Thus BioID2 improves the efficiency of screening for protein–protein associations. We also demonstrate that the biotinylation range of BioID2 can be considerably modulated using flexible linkers, thus enabling application-specific adjustment of the biotin-labeling radius.

Significance Proximity-dependent biotinylation (BioID) is a readily accessible method for identifying protein associations that occur in living cells. Fusion of a promiscuous biotin ligase to a bait protein for expression in live cells enables covalent biotin labeling, and thus identification, of proteins proximate to the bait. Here we used BioID to probe the organization of the nuclear pore complex, a large structure that regulates molecular transport between the nucleus and cytoplasm. These studies enhance our understanding of major subcomplexes within the nuclear pore complex and demonstrate the utility of BioID for studying the organization of large protein assemblies. Additionally, we have measured the labeling radius of BioID, thus enabling the rational application of this method and more meaningful data interpretation.

Abstract We report on the combination of nanodroplet sample preparation, ultra-low-flow nanoLC, high-field asymmetric ion mobility spectrometry (FAIMS), and the latest-generation Orbitrap Eclipse Tribrid mass spectrometer for greatly improved single-cell proteome profiling. FAIMS effectively filtered out singly charged ions for more effective MS analysis of multiply charged peptides, resulting in an average of 1056 protein groups identified from single HeLa cells without MS1-level feature matching. This is 2.3 times more identifications than without FAIMS and a far greater level of proteome coverage for single mammalian cells than has been previously reported for a label-free study. Differential analysis of single microdissected motor neurons and interneurons from human spinal tissue indicated a similar level of proteome coverage, and the two subpopulations of cells were readily differentiated based on single-cell label-free quantification.

ABSTRACT In the young field of single-cell proteomics (scMS), there is a great need for improved global proteome characterization, both in terms of proteins quantified per cell and quantitative performance thereof. The recently introduced real-time search (RTS) on the Orbitrap Eclipse Tribrid mass spectrometer in combination with SPS-MS3 acquisition has been shown to be beneficial for the measurement of samples that are multiplexed using isobaric tags. Multiplexed single-cell proteomics requires high ion injection times and high-resolution spectra to quantify the single-cell signal, however the carrier channel facilitates peptide identification and thus offers the opportunity for fast on-the-fly precursor filtering before committing to the time intensive quantification scan. Here, we compared classical MS2 acquisition against RTS-SPS-MS3, both using the Orbitrap Eclipse Tribrid MS with the FAIMS Pro ion mobility interface and present a new acquisition strategy termed RETICLE ( R TS E nhanced Quan t of S i ngle C el l Sp e ctra) that makes use of fast real-time searched linear ion trap scans to preselect MS1 peptide precursors for quantitative MS2 Orbitrap acquisition. We show that classical MS2 acquisition is outperformed by both RTS-SPS-MS3 through increased quantitative accuracy at similar proteome coverage, and RETICLE through higher proteome coverage, with the latter enabling the quantification of over 1000 proteins per cell at a MS2 injection time of 750ms using a 2h gradient.

Abstract Background The wide dynamic range of circulating proteins coupled with the diversity of proteoforms present in plasma has historically impeded comprehensive and quantitative characterization of the plasma proteome at scale. Automated nanoparticle (NP) protein corona-based proteomics workflows can efficiently compress the dynamic range of protein abundances into a mass spectrometry (MS)-accessible detection range. This enhances the depth and scalability of quantitative MS-based methods, which can elucidate the molecular mechanisms of biological processes, discover new protein biomarkers, and improve comprehensiveness of MS-based diagnostics. Methods Investigating multi-species spike-in experiments and a cohort, we investigated fold-change accuracy, linearity, precision, and statistical power for the using the Proteograph™ Product Suite, a deep plasma proteomics workflow, in conjunction with multiple MS instruments. Results We show that NP-based workflows enable accurate identification (false discovery rate of 1%) of more than 6,000 proteins from plasma (Orbitrap Astral) and, compared to a gold standard neat plasma workflow that is limited to the detection of hundreds of plasma proteins, facilitate quantification of more proteins with accurate fold-changes, high linearity, and precision. Furthermore, we demonstrate high statistical power for the discovery of biomarkers in small- and large-scale cohorts. Conclusions The automated NP workflow enables high-throughput, deep, and quantitative plasma proteomics investigation with sufficient power to discover new biomarker signatures with a peptide level resolution.

Development of therapies for CLN3 Batten disease, a rare pediatric lysosomal storage disorder, has been hindered by the lack of etiological insights and translatable biomarkers to clinics. Here, we used a deep multi-omics approach to discover new biomarkers using longitudinal serum samples from a porcine model of CLN3 disease. Comprehensive metabolomics was combined with a nanoparticle-based LC-MS-based proteomic profiling coupled with TMTpro 18-plex to generate quantitative data on 769 metabolites and 2,634 proteins, collectively the most exhaustive multi-omics profile conducted on serum from a porcine model, which was previously impossible due a to lack of efficient deep serum proteome profiling technologies compatible with model organisms. The presymptomatic disease state was characterized by elevations in glycerophosphodiester species and lysosomal proteases, while later timepoints were enriched with species involved in immune cell activation and sphingolipid metabolism. Cathepsin S, Cathepsin B, glycerophosphoinositol, and glycerophosphoethanolamine captured a large portion of the genotype-correlated variation between healthy and diseased animals, suggesting that an index score based on these analytes could have great utility in the clinic.

ABSTRACT Genome-wide association studies (GWAS) with proteomics generate hypotheses on protein function and offer genetic evidence for drug target prioritization. Although most protein quantitative loci (pQTLs) have so far been identified by high-throughput affinity proteomics platforms, these methods also have some limitations, such as uncertainty about target identity, non-specific binding of aptamers, and inability to handle epitope-modifying variants that affect affinity binding. Mass spectrometry (MS) proteomics has the potential to overcome these challenges and broaden the scope of pQTL studies. Here, we employ the recently developed MS-based Proteograph™ workflow ( Seer, Inc .) to quantify over 18,000 unique peptides from almost 3,000 proteins in more than 320 blood samples from a multi-ethnic cohort. We implement a bottom-up MS-proteomics approach for the detection and quantification of blood-circulating proteins in the presence of protein altering variants (PAVs). We identify 184 PAVs located in 137 genes that are significantly associated with their corresponding variant peptides in MS data (MS-PAVs). Half of these MS-PAVs (94) overlap with cis -pQTLs previously identified by affinity proteomics pQTL studies, thus confirming the target specificity of the affinity binders. An additional 54 MS-PAVs overlap with trans -pQTLs (and not cis -pQTLs) in affinity proteomics studies, thus identifying the putatively causal cis -encoded protein and providing experimental evidence for its presence in blood. The remaining 36 MS-PAVs have not been previously reported and include proteins that may be inaccessible to affinity proteomics, such as a variant in the incretin pro-peptide (GIP) that associates with type 2 diabetes and cardiovascular disease. Overall, our study introduces a novel approach for analyzing MS-based proteomics data within the GWAS context, provides new insights relevant to genetics-based drug discovery, and highlights the potential of MS-proteomics technologies when applied at population scale. Highlights This is the first pQTL study that uses the Proteograph ™ ( Seer Inc .) mass spectrometry-based proteomics workflow. We introduce a novel bottom-up proteomics approach that accounts for protein altering variants in the detection of pQTLs. We confirm the target and potential epitope effects of affinity binders for cis- pQTLs from affinity proteomics studies. We establish putatively causal proteins for known affinity proteomics trans -pQTLs and confirm their presence in blood. We identify novel protein altering variants in proteins of clinical relevance that may not be accessible to affinity proteomics. Graphical abstract