George Daley and colleagues show that Lin28 and Lin28B promote cellular transformation by repressing let-7 family members, leading to derepression of let-7 targets. They also find that LIN28 and LIN28B are overexpressed in ∼15% of primary human tumors and cancer cell lines and that their expression is associated with aggressive disease and poor prognosis across multiple tumor types. Multiple members of the let-7 family of miRNAs are often repressed in human cancers1,2, thereby promoting oncogenesis by derepressing targets such as HMGA2, K-Ras and c-Myc3,4. However, the mechanism by which let-7 miRNAs are coordinately repressed is unclear. The RNA-binding proteins LIN28 and LIN28B block let-7 precursors from being processed to mature miRNAs5,6,7,8, suggesting that their overexpression might promote malignancy through repression of let-7. Here we show that LIN28 and LIN28B are overexpressed in primary human tumors and human cancer cell lines (overall frequency ∼15%), and that overexpression is linked to repression of let-7 family miRNAs and derepression of let-7 targets. LIN28 and LIN28b facilitate cellular transformation in vitro, and overexpression is associated with advanced disease across multiple tumor types. Our work provides a mechanism for the coordinate repression of let-7 miRNAs observed in a subset of human cancers, and associates activation of LIN28 and LIN28B with poor clinical prognosis.

In an effort to find new pharmacological modalities to overcome resistance to ATP-binding-site inhibitors of Bcr–Abl, we recently reported the discovery of GNF-2, a selective allosteric Bcr–Abl inhibitor. Here, using solution NMR, X-ray crystallography, mutagenesis and hydrogen exchange mass spectrometry, we show that GNF-2 binds to the myristate-binding site of Abl, leading to changes in the structural dynamics of the ATP-binding site. GNF-5, an analogue of GNF-2 with improved pharmacokinetic properties, when used in combination with the ATP-competitive inhibitors imatinib or nilotinib, suppressed the emergence of resistance mutations in vitro, displayed additive inhibitory activity in biochemical and cellular assays against T315I mutant human Bcr–Abl and displayed in vivo efficacy against this recalcitrant mutant in a murine bone-marrow transplantation model. These results show that therapeutically relevant inhibition of Bcr–Abl activity can be achieved with inhibitors that bind to the myristate-binding site and that combining allosteric and ATP-competitive inhibitors can overcome resistance to either agent alone. The success of Bcr–Abl tyrosine kinase inhibitors such as imatinib (Gleevec) in treating chronic myelogenous leukaemia (CML) has generated intense interest in the potential of targeting signal transduction mechanisms to create new anticancer drugs. But the picture is complicated by the emergence of inhibitor-resistant kinase alleles. One way to overcome these resistant mutants is to design new ATP-competitive inhibitors, as demonstrated by the second-generation Bcr–Abl inhibitors nilotinib and dasatinib. Zhang et al. have pursued an alternative approach by developing inhibitors that can regulate kinase activity by binding outside of the ATP-binding site. They now demonstrate that GNF-2, a selective allosteric Bcr–Abl inhibitor, binds to the myristate-binding site of the Abl protein. When GNF-5, an analogue of GNF-2 with improved pharmacokinetic properties, was used in combination with imatinib or nilotinib, the emergence of drug-resistance mutations was suppressed in vitro. In addition, the combination of the two classes of small molecules displayed efficacy in vivo against the recalcitrant T315I Bcr–Abl mutant in a murine bone-marrow transplantation model. These results indicate that the combination of allosteric and ATP-competitive inhibitors can overcome resistance to either agent alone. GNF-2 is a recently discovered, selective allosteric Bcr–Abl inhibitor. Solution NMR, X-ray crystallography, mutagenesis and hydrogen exchange mass spectrometry are now used to show that GNF-2 binds to the myristate-binding site of Abl, leading to changes in the structural dynamics of the ATP-binding site. The results show that the combination of allosteric and ATP-competitive inhibitors can overcome resistance to either agent alone.

ABSTRACT MYCN amplification and disruption of tumor suppressor microRNA (TSmiR) function are central drivers of poor outcomes in neuroblastoma (NB). MYC, MYCN, and TSmiRs regulate glucose metabolism; however, their role in unsaturated fatty acid synthesis (UFAS) remains poorly understood. Here we show that de novo and UFAS pathway genes FASN , ELOVL6 , SCD , FADS2 , and FADS1 are upregulated in high-risk NB and are associated with poor prognosis. RNA-Seq analysis of eight human NB cell lines revealed parallel UFAS gene expression patterns. Consistent with this, we found that NB-related TSmiRs were predicted to extensively target these genes. In addition, we observed that both MYC and MYCN upregulated UFAS pathway genes while suppressing TSmiR host gene expression, thereby creating a possible UFAS regulatory network between MYCN and TSmiRs in NB. Furthermore, NB cells are high in omega 9 (ω9) unsaturated fatty acids that can be synthesized de novo and low in both ω6 and ω3, providing a plausible means for NB to limit cell-autonomous immune stimulation and reactive oxygen species (ROS)-driven apoptosis from ω6 and ω3 unsaturated fatty acid derivatives, respectively. We propose a model in which the UFAS pathway, through novel regulation by MYCN and TSmiRs, plays a key role in neuroblastoma pathology with implications for other MYC -driven cancers.

Functional gene disruption is a central tenet of cancer research, where novel drug targets are often identified and validated through cell-growth based knockdown studies or screens. Short hairpin RNA (shRNA)-mediated mRNA knockdown is widely used in both academic and pharmaceutical settings. However, off-target effects of shRNAs as well as interference with endogenous small RNA processing have been reported. We show here that lentiviral delivery of both gene-specific and non-targeting control shRNAs impair in vitro cell growth in a sequence independent manner. In addition, exogenous shRNAs induce a depressed cell-cycle-gene expression signature that is also shRNA-sequence independent and present across several studies. Further, we observe an shRNA mediated general repression of microRNAs belonging to polycistronic genetic clusters, including microRNAs from established oncogenic microRNA clusters. The collective impact of these observations is particularly relevant for cancer research, given the widespread historical use of shRNAs and the common goal of interrogating genes that regulate proliferation. We therefore recommend that when employing shRNA for target validation, care be taken to titrate shRNA dose, use hairpin-expressing controls, perform gene-of-interest rescue experiments and/or corroborate shRNA-derived results by small interfering RNA (siRNA) knockdown or CRISPR/Cas9-mediated genetic knockout. Minimizing these deleterious sequence independent effects will improve research fidelity and help address reported challenges in experimental reproducibility.

Abstract Neuroblastoma (NB) is a genetically diverse, highly metastatic pediatric cancer that accounts for an estimated 8% of childhood cancer incidence but is responsible for 15% of childhood cancer deaths. High-risk and relapsed cases have less than 50% and near 5% survival, respectively. The current standard of care is highly genotoxic, resulting in life-long health issues and an increased risk of new cancer incidence. Effective and less toxic approaches to neuroblastoma remain elusive. We show here that ω3 and ω6 highly unsaturated fatty acids (HUFA) have differential effects on tumor formation in a syngeneic model of neuroblastoma. We observe that 20 gram/d doses of ω3 DHA and EPA have a robust antitumor effect, wherein DHA and high-dose EPA completely abrogate tumor formation. In contrast, ω6 arachidonic acid (ARA) has the opposite effect, driving higher tumor penetrance and shorter latency. When used together, ARA and EPA treatment results in a reduced tumor burden analogous to the control group, indicating that EPA may directly oppose the mechanism of ARA-mediated tumor formation. ROS-resistant deuterated DHA (D-DHA), which has deuterium atoms in place of ordinary 1 H (protium) in the oxidatively labile bis allylic positions, also completely abrogated tumor formation, strongly suggesting that the mechanism of action is not through oxidation as might have been expected. Interestingly, despite high levels of fatty acid delivery, very little tissue accumulation was observed. These results suggest that high doses of ω3 HUFA DHA and EPA may represent a viable, low-toxicity avenue for neuroblastoma therapy.

The worst patient outcomes in neuroblastoma are driven by high-risk disease, which is divided into similarly sized MYCN amplified and MYCN non-amplified patient subgroups. Male patients have been reported to have slightly worse outcomes than females in all-patient analyses of large patient studies. However, we show here that in MYCN non-amplified high-risk and stage 4s low-risk disease, female patients have significantly worse overall survival than males. Female MYCN non-amplified high-risk patients highly express H19 and DLK1, both of which drive cell growth in vitro and associate with worse outcomes in females, but not males. Further, chromosome-specific expression analysis of these patients reveals broad sex disparities in chromosomal patterning, including female-specific retention of chromosome 11q, a pattern typically reserved for MYCN-amplified disease. Finally, we show that H19, a known let-7 microRNA target, sequesters let-7 in females, providing a rationale for worse female survival and reconciling retention of chromosome 11q. We propose that this novel sex-based outcome disparity is driven by let-7 inhibition, confirming and expanding on a model of neuroblastoma development where let-7 mitigation is central to disease pathology.