Abstract Small RNA-seq is increasingly being used for profiling of small RNAs. Quantitative characteristics of long RNA-seq have been extensively described, but small RNA-seq involves fundamentally different methods for library preparation, with distinct protocols and technical variations that have not been fully and systematically studied. We report here the results of a study using common references (synthetic RNA pools of defined composition, as well as plasma-derived RNA) to evaluate the accuracy, reproducibility and bias of small RNA-seq library preparation for five distinct protocols and across nine different laboratories. We observed protocol-specific and sequence-specific bias, which was ameliorated using adapters for ligation with randomized end-nucleotides, and computational correction factors. Despite this technical bias, relative quantification using small RNA-seq was remarkably accurate and reproducible, even across multiple laboratories using different methods. These results provide strong evidence for the feasibility of reproducible cross-laboratory small RNA-seq studies, even those involving analysis of data generated using different protocols.

Abstract Embryo implantation in humans is remarkably inefficient for reasons that remain largely unexplained, and high rates of implantation failure remain one of the greatest obstacles in treating infertility. The volume of gene expression data available from human embryos has rapidly accumulated in recent years. However, prioritization of these data to identify the subset of genes that determine successful implantation remains a challenge, in part, because comprehensive analyses cannot be performed on the same embryos that are transferred. Here, we leverage clinical morphologic grading—known for decades to correlate with implantation potential—and transcriptome analyses of matched embryonic and abembryonic samples to identify genes and cell-cell interactions enriched and depleted in human blastocysts of good and poor morphology, genome-wide. Unexpectedly, we discovered that the greatest molecular difference was in the state of the extraembryonic primitive endoderm (PrE), with relative deficiencies in PrE development in embryos of poor morphology at the time of embryo transfer. Together, our results support a model in which implantation success is most strongly reflected by factors and signals from the embryonic compartment and suggest that deficiencies in PrE development, in particular, are common among embryos with reduced implantation potential. Our study provides a valuable resource for those investigating the markers and mechanisms of human embryo implantation.

MicroRNAs (miRNAs) found in biofluids play functional roles in health and in disease pathogenesis, underpinning their potential as clinical biomarkers. Several platforms for measurement of extracellular RNAs have recently become available. We evaluated the reproducibility, accuracy, sensitivity, and specificity of four miRNA quantification platforms, including one widely used discovery approach (small RNA-seq) and three targeted platforms (FirePlex, EdgeSeq, and nCounter). Using pools of synthetic miRNAs, we observed that reproducibility was highest for RNA-seq and EdgeSeq, that all three targeted platforms had lower bias than RNA-seq, and that RNA-seq had the best ability to distinguish between present and absent sequences. Overall reproducibility was lower for plasma samples than synthetic miRNA pools. We compared expression of placental miRNAs in plasma from pregnant and non-pregnant women and observed expected differences with RNA-seq and EdgeSeq, but not FirePlex or nCounter. We conclude that differences in performance among miRNA profiling platforms impact their relative utility as potential assay systems for clinical biomarkers.

Extracellular vesicles (EV) mediate intercellular signaling by transferring their cargo to recipient cells. Red blood cell (RBC)-derived EVs constitute a significant proportion of circulating EVs and have been implicated in regulating immune responses. Here, we describe a transgenic mouse model for fluorescent-based mapping of RBC-EV target cells based on the functional transfer of EV-contained Cre-recombinase to target cells. In a murine model of ischemic heart failure, we detect an increase in RBC-EV-targeted cardiomyocytes in the hearts and microglial cells in the brains. Cells targeted by RBC-EVs present an enrichment of genes implicated in cell proliferation and metabolism pathways compared to non-recombined (non-targeted) cells. Cardiomyocytes targeted by RBC-EVs are more likely to demonstrate cellular markers of DNA synthesis and proliferation, suggesting functional significance of EV-mediated signaling. In conclusion, we leverage our mouse model for mapping of RBC-EV targets in murine ischemic heart failure to demonstrate quantitative and qualitative changes in RBC-EV recipients.