Abstract Single-cell RNA sequencing is now a standard method used to reveal the molecular details of cellular heterogeneity, but current approaches have limitations on speed, scale, and ease of use that stem from the complex microfluidic devices or fluid handling steps required for sample processing. We, therefore, developed a method that does not require specialized microfluidic devices, expertise, or hardware. Our approach is based on particle-templated emulsification, which allows single-cell encapsulation and barcoding of cDNA in uniform droplet emulsions with only a vortexer. PIP-seq accommodates a wide range of emulsification formats, including microwell plates and large-volume conical tubes, enabling thousands of samples or millions of cells to be processed in minutes. We demonstrate that PIP-seq produces high-purity transcriptomes in mouse-human mixing studies, is compatible with multi-omics measurements, and can accurately characterize cell types in human breast tissue when compared to a commercial microfluidic platform. Single-cell transcriptional profiling of mixed phenotype acute leukemia using PIP-seq revealed the emergence of heterogeneity within chemotherapy-resistant cell subsets that were hidden by standard immunophenotyping. PIP-seq is a simple, flexible, and scalable next-generation workflow that extends single-cell sequencing to new applications, including screening, diagnostics, and disease monitoring.

ABSTRACT Tumor heterogeneity is a primary cause of treatment failure and acquired resistance in cancer patients. Even in cancers driven by a single mutated oncogene, variability of targeted therapy response is observed. Additional genetic mutations can only partially explain this variability, leading to consideration of non-genetic factors, such as “stem-like” and “mesenchymal” phenotypic states, as critical contributors to tumor relapse and resistance. Here, we show that both genetic and non-genetic factors contribute to targeted drug-response variability in an experimental tumor heterogeneity model based on multiple versions and clonal sublines of PC9, the archetypal EGFR-mutant non-small cell lung cancer cell line. We observe significant drug-response variability across PC9 cell line versions, among sublines, and within sublines. To disentangle genetic, epigenetic, and stochastic components underlying this variability, we adopt a theoretical framework whereby distinct genetic states give rise to multiple epigenetic “basins of attraction”, across which cells can transition driven by stochastic factors such as gene expression noise and asymmetric cell division. Using mutational impact analysis, single-cell differential gene expression, and semantic similarity of gene ontology terms to connect genomics and transcriptomics, we establish a baseline of genetic differences explaining drug-response variability across PC9 cell line versions. In contrast, with the same approach, we conclude that in all but one of the clonal sublines, drug-response variability is due to epigenetic rather than genetic differences. Finally, using a clonal drug-response assay and stochastic simulations, we attribute drug-response variability within sublines to intracellular stochastic fluctuations and confirm that one subline likely contains a genetic resistance mutation that emerged in the absence of selective pressures. We propose that a theoretical framework deconvolving the complex interplay among genetic, epigenetic, and stochastic sources of intratumoral heterogeneity will lead to novel therapeutic strategies to combat tumor relapse and resistance.

ABSTRACT There is increasing interest in cancer cell subpopulations that can withstanding treatment via non-genetic mechanisms, such as tumor cell plasticity and adaptation. These cell populations may be comprised of cells with diverse phenotypes, e.g., quiescent or slow cycling. Such populations have been broadly termed “drug-tolerant persisters” (DTPs) and may be responsible for minimal residual disease following anticancer treatment and acquired resistance. Understanding molecular mechanisms that drive emergence of DTPs could lead to new strategies to improve therapeutic outcomes. Recently, we reported that BRAF-mutant melanoma cells under prolonged BRAF inhibition enter a DTP state with balanced cell death and division, which we termed “idling.” Here, we apply single cell barcoding to show that idling DTP populations emerge via cell state transitions, rather than selection of a few pre-existing drug-tolerant clones. Within the time frame of our experiments, DTPs exhibit varying proportions of fast- and slow-cycling cells within each lineage, suggesting that entry into the DTP state is a stochastic process. Furthermore, single-cell transcriptomics and bulk epigenomics reveal common gene expression and ontology signatures in DTP lineages that are consistent with rebalancing of ion channels. Calcium flux experiments uncover a reduction of divalent cation reserves in intracellular organelles, likely leading to endoplasmic reticulum stress. Accordingly, idling DTPs are more prone to ferroptotic cell death, as indicated by increased sensitivity to inhibition of glutathione peroxidase 4 (GPX4), which prevents removal of toxic lipid peroxides. In summary, we propose that ion channel homeostasis is a central process underlying idling DTP emergence in BRAF-mutated melanoma. Future studies will investigate translational aspects of this insight.

Melanomas harboring BRAF mutations can be treated with BRAF inhibitors (BRAFi), but responses are varied and tumor recurrence is inevitable. Here, using an integrative approach of experimentation and mathematical flux balance analyses in BRAF -mutated melanoma cells, we report that elevated antioxidant capacity is linked to BRAFi sensitivity in melanoma cells. High levels of antioxidant metabolites in cells with reduced BRAFi sensitivity confirm this conclusion. By extending our analyses to other melanoma subtypes in TCGA, we predict that elevated redox capacity is a general feature of melanomas, not previously observed. We propose that redox vulnerabilities could be exploited for therapeutic benefits and identify unsuspected combination targets to enhance the effects of BRAFi in any melanoma, regardless of mutational status.

Cancer cells adjust their metabolic profiles to evade treatment. Metabolic adaptation is complex and hence better understood by an integrated theoretical-experimental approach. Using a minimal kinetic model, we predicted a previously undescribed Low/Low phenotype, characterized by low oxidative phosphorylation (OXPHOS) and low glycolysis. Here, we report that L/L metabolism is observed in BRAF -mutated melanoma cells that enter a drug-tolerant “idling state” upon long-term MAPK inhibition (MAPKi). Consistently, using publicly available RNA-sequencing data of both cell lines and patient samples, we show that melanoma cells decrease their glycolysis and/or OXPHOS activity upon MAPKi and converge toward the L/L phenotype. L/L metabolism is unfavorable for tumor growth, yet supports successful cell division at ∼50% rate. Thus, L/L drug-tolerant idling cells are a reservoir for accumulating mutations responsible for relapse, and should be considered as a target subpopulation for improving MAPKi outcomes in melanoma treatment.Statement of Significance Tumor relapse is almost universal during drug treatment of melanoma patients. Theory coupled with experimentation has uncovered a previously undescribed metabolically inactive state in melanoma upon MAPKi treatment, pointing to novel strategies to prevent relapse.

Mixed phenotype acute leukemia (MPAL) is a leukemia whose biologic drivers are poorly understood, therapeutic strategy remains unclear, and prognosis is poor. We performed multiomic single cell (SC) profiling of 14 newly diagnosed adult MPAL patients to characterize the immunophenotypic, genetic, and transcriptional landscapes of MPAL. We show that neither genetic profile nor transcriptome reliably correlate with specific MPAL immunophenotypes. However, progressive acquisition of mutations is associated with increased expression of immunophenotypic markers of immaturity. Using SC transcriptional profiling, we find that MPAL blasts express a stem cell-like transcriptional profile distinct from other acute leukemias and indicative of high differentiation potential. Further, patients with the highest differentiation potential demonstrated inferior survival in our dataset. A gene set score, MPAL95, derived from genes highly enriched in this cohort, is applicable to bulk RNA sequencing data and was predictive of survival in an independent patient cohort, suggesting utility for clinical risk stratification.